HPLC法检测面条中的乙二胺四乙酸二钠

◎ 许 秦，刘依涵

（昆明市食品药品检验所，云南 昆明 650000）

乙二胺四乙酸二钠是食品安全国家标准GB 2760-2014《食品添加剂使用标准》中允许使用的添加剂，有防腐、稳定、抗氧化、凝固的作用，可以被用于饮料制品、乳制品、酱腌菜、罐头及果脯等食品中。若不按规定或超限量使用乙二胺四乙酸二钠，就会影响人的身体健康，导致人体中微量元素的流失，对上呼吸道、眼睛、黏膜产生影响，可引起呕吐、腹泻、和急腹痛等症状，还可引起暂时性的肾脏功能障碍或血压下降。我国食品安全标准中规定了乙二胺四乙酸二钠作为食品中添加剂的使用规则、允许使用的食品种类和允许使用量的范围及残留量，但面条中不允许添加乙二胺四乙酸二钠[1]。

在实际的食品监管中发现，乙二胺四乙酸二钠能降低面粉中多酚氧化酶的活性，延缓面条酶促褐变的过程，减少对面条感官品质和营养成分的影响。因此，一些面条商贩为了使面条的外观好看、劲道和口感好，存在超限量使用乙二胺四乙酸二钠的情况。

目前，国内外有很多快速高效检测乙二胺四乙酸二钠的相关文献，主要的检测方法有HPLC法、LC-MS法、气相色谱法、分光光度法、毛细管电泳法、离子色谱法等[2-7]。我国关于检测食品中乙二胺四乙酸二钠的标准有SN/T 3855-2014和GB 5009.249-2016等，适用于饮料、果脯、酱腌菜和铁强化酱油等食品的检测，没有面条中乙二胺四乙酸二钠的检测方法[8]。本文拟建立一种快速高效检测面条中乙二胺四乙酸二钠的方法，为实际的食品监管工作中乙二胺四乙酸二钠含量的测定提供一定的技术参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

赛默飞Ultimate3000高效液相色谱仪（配备DAD检测器）、AL104电子天平（梅特勒-托利多）、ALLEGRAX-30R离心机（美国贝克曼库尔特有限公司）、KQ5200DB超声仪（昆山市超声仪器有限公司）。

乙二胺四乙酸二钠标准品（购于Stanford Chemicals公司）、盐酸（GR）、甲醇（色谱纯）、三氯甲烷（色谱纯）、三氯化铁（AR）、抗坏血酸（AR）、乙酸钠（AR）、四丁基溴化铵（AR），试验用水均为去离子水；超市购买2种面条。

1.2 实验方法

1.2.1 0.02 mol·L-1三氯化铁溶液的配制

准确称取0.540 6 g FeCl3·6H2O，溶解于90 mL水中，加入0.03 mL盐酸，转移至100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀。

1.2.2 标准溶液的配制

准确称取乙二胺四乙酸二钠标准品0.100 40 g至50 mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，得2.008 mg·mL-1的乙二胺四乙酸二钠标准储备液。准确吸取乙二胺四乙酸二钠储备液0.05、0.1、0.25、0.5、1.0 mL和2.0 mL于含有20 mg抗坏血酸的50 mL容量瓶中，加入适量水和1 mL FeCl3溶液，超声15 min，冷却至室温后，用水定容至刻度，即得含乙二胺四乙酸二钠 2.008、4.016、10.04、20.08、40.16 μg·mL-1和80.32 μg·mL-1的系列标准溶液。

1.2.3 样品前处理及衍生化

准确称取粉碎过的样品5 g（精确到0.01 g）于50 mL已具有20 mg抗坏血酸的离心管中，加入15 mL水，涡旋 2 min，4 500 r·min-1离心 5 min，将上清液转移至50 mL离心管中，15 mL水重复提取1次，合并提取液于50 mL容量瓶中。向提取液中加入1.0 mL FeCl3溶液，超声20 min，冷却至室温后定容至刻度，混匀后过0.45 μm滤膜，滤液备用。

1.2.4 色谱条件

色谱柱：Waters Sunfire C184.6×150 mm，5 μm；流速：1.0 mL·min-1，柱温：30 ℃，流动相为甲醇∶水（含有 0.02 mol·L-1四丁基溴化胺和 0.03 mol·L-1乙酸钠缓冲溶液，用磷酸调节pH=4）=1∶4。进样量：20 μL，检测波长为254 nm。

2 结果与分析

2.1 检测波长和络合剂的选择

乙二胺四乙酸二钠能够与大多数金属离子形成稳定的络合物，且优先与稳定常数大的金属离子进行络合。乙二胺四乙酸二钠与三价铁离子络合化合物的稳定常数大于与二价铜离子络合化合物的稳定常数，因此选用FeCl3作为络合剂。对其络合物在190～400 nm进行全波长扫描，最大吸收波长在250 nm附近（见图1），因此本方法采用254 nm波长检测。

图1 乙二胺四乙酸二钠络合物等吸收图

2.2 流动相的选择

据相关的检测标准，乙二胺四乙酸二钠检测流动相有两种：①SN/T 3855-2014《出口食品中乙二胺四乙酸二钠的测定》中所用的流动相，为0.075 mol·L-1的磷酸二氢钾（pH=2.3）-甲醇（90∶10，V/V）。②SN/T 1018-2001《出口食品罐头中乙二胺四乙酸二钠的测定》方法中所用的四丁基溴化胺-乙酸钠混合溶液（pH=4.0）-甲醇（80∶20，V/V）。高效液相色谱法测定腌渍蔬菜罐头中乙二胺四乙酸二钠的含量中，对两种流动相的研究表明四丁基溴化胺-乙酸钠混合溶液作为流动相时，检测更佳[9-11]。因此本实验选择四丁基溴化胺-乙酸钠混合溶液作为流动相。在该实验条件下，乙二胺四乙酸二钠络合物峰型良好（见图2），满足实验要求。

图2 乙二胺四乙酸二钠络合物色谱图

2.3 线性范围

在该确定的实验条件下，以乙二胺四乙酸二钠络合物的浓度为横坐标，其峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明当络合物的质量浓度2.0～80.0 μg·mL-1时呈现良好的线性关系，相关系数为1.000 0（见图3），回归方程为y=0.474 8x-0.035 6。

图3 乙二胺四乙酸二钠络合物标准曲线图

2.4 样品前处理

SN/T 3855-2014《出口食品中乙二胺四乙酸二钠的测定》中在提取时均需要加入三氯甲烷，衍生化后也需要加入三氯甲烷进行净化[12-13]。加入三氯甲烷的原因是为了除去色素、脂肪等杂质的干扰，但由于面条中杂质较少，结果显示面条样品中加入三氯甲烷进行除杂质和净化和不加三氯甲烷，不会在色谱图上产生明显差异（见图4和图5）。在样品中均未检测到乙二胺四乙酸二钠。

图4 样品前处理不加三氯甲烷图

图5 样品前处理加三氯甲烷图

2.5 方法的加标回收率

前处理方法按加三氯甲烷和不加氯甲烷两种，以不含乙二胺四乙酸二钠的面条为样品，做3个添加水平，每个添加水平平行测定6次，检测方法的回收率。结果表明前处理方法加三氯甲烷和不加三氯甲烷的加标回收率也无太大差异，见表1、表2。因此，对于面条样品的处理，可以不加三氯甲烷除杂质和净化。

表1 不加三氯甲烷方法回收率表（n=6）

表2 加三氯甲烷方法回收率表（n=6）

2.6 检出限与定量限

向空白面条粉末基质中标准品，以3倍信噪比（S/N=3）确定检出限（LOD）为3.34 mg·kg-1；以10倍信噪比（S/N=10）确定定量限（LOQ）为11.15 mg·kg-1。

2.7 精密度

称取5 g面条样品，加入0.5 mL 2.008 mg·mL-1的标准储备液，平行测定6次，测得RSD为0.065%，表明该方法重复性良好，准确可靠，满足实验需求。

3 结论

本文建立了面条中乙二胺四乙酸二钠的高效液相色谱方法和前处理方法，乙二胺四乙酸二钠的络合物质量浓度为2.0～80.0 μg·mL-1，线性关系良好，相关系数为1.000 0，加标回收率为92.48%～98.02%，RSD为0.065%。该方法操作简便，准确度、精密度都比较高，为今后面条中乙二胺四乙酸二钠的检测提供了方法和技术参考。