剑叶龙血树总黄酮对缺氧复氧处理后H9c2心肌细胞的保护作用*

吴堃，李光，李宜航，吕亚娜，肖建琴，孙慧峰

(1.黑龙江中医药大学药学院，哈尔滨 150040；2.中国医学科学院药用植物研究所云南分所，景洪 666100；3.西双版纳傣药南药重点实验室，景洪 666100；4.云南中医学院，昆明 650500)

剑叶龙血树[Dracaenacochinchinensis(Lour) S.C.Chen]含树脂木材是国产血竭的主要生产原料。国产血竭又称龙血竭，是伤科要药，具有活血化瘀、止血、镇痛、解痉、抗炎及降糖作用[1]。药理研究表明龙血竭具有抗炎镇痛、保护心肌细胞、抗血小板聚集等作用，被誉为“活血之圣药”[2-4]。由于龙血竭疗效明确，临床用量不断增加，而且国内剑叶龙血树濒临灭绝[5]，提高剑叶龙血树资源利用度成为目前保护其资源的重要手段之一。

缺氧复氧处理H9c2心肌细胞模型是目前研究心肌缺血-再灌注损伤(myocardial ischemia / reperfusion injury，MIRI)最常见的体外模型[6-7]，目前MIRI已成为临床上影响冠心病患者获得再灌注最佳疗效的主要障碍，临床上尚无有效药物进行干预[8]。龙血竭中黄酮类成分能够改善心肌缺血大鼠的心脏功能[9]，并且对动脉血栓的形成具有明显的抑制作用[10]。笔者尚未见关于从剑叶龙血树含脂木材中提取得到总黄酮类成分的药效学报道。通过研究剑叶龙血树黄酮的药效，对深入开发剑叶龙血树资源，提高其利用度具有重要意义。

1 材料与方法

1.1实验材料 大鼠H9c2心肌细胞株，为大鼠胚胎心肌层细胞(Procell公司，货号：CL-0089)；剑叶龙血树含脂木材(西双版纳柬龙制药有限公司，由中国医学科学院药用植物研究所云南分所李学兰研究员鉴定)；龙血素B对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111558-201407)，二甲亚砜(DMSO)(VWR公司，批号：0666C081)；胰蛋白酶(Gibco公司，批号：1869505)；脱脂奶粉(BD公司，批号：1785989)；胎牛血清(Procell公司，批号：20151206)；达尔伯克改良伊格尔(DMEM)高糖培养基(Hyclone公司，批号：AB217802)；DMEM无糖培养基(Gibco公司，批号：1810192)；电化学发光(ECL)试剂盒(批号：0181508)、二辛可酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量试剂盒(批号：00171509)、哺乳动物细胞蛋白抽提试剂盒(批号：00041503)、转膜液(批号：00151511)、聚丙烯酰胺凝胶电泳液(批号：202010)、TBST缓冲液(批号：40147)均购自康为世纪公司；PI3K抗体(批号：2592322)、Akt抗体(批号：2626023)、Caspase-3抗体(批号：2631150)、Bcl-2(批号：2436331)均购自Millipore公司；Bax抗体(Abcam公司，批号：GR187478-10)； Caspase-8抗体(Abcam公司，批号：GR227627-3)；细胞凋亡流式试剂盒(Thermo公司，批号：V13242)；CCK-8(江苏碧云天公司，C0038)。

1.2仪器与设备 ACQUITY UPLC H-CLASS超高效液相色谱仪，PDA eλ检测器(Waters公司)；SW-CJ-1F超净工作台(苏净集团苏州安泰空气技术有限公司)；XK96-8旋转振荡器(江苏新康医疗器械有限公司)；Spectramax i3酶标仪[美谷分子仪器(上海)有限公司]；VE-180B电泳槽(上海天能科技有限公司)；Tanon 5200 Multi凝胶成像仪(上海天能科技有限公司)；SiGmA3K15，SiGmA1-14离心机(德国西格玛sigma公司)；NU-4950三气培养箱(美国Nuaire公司)；HF160W二氧化碳培养箱(上海力申科学技术有限公司)。

1.3实验方法

1.3.1剑叶龙血树总黄酮(Dracaenacochinchinensisflavonoids，DCF)提取和精制 将剑叶龙血树含脂木材粉碎后，粉碎过孔径0.180 mm(80目)筛，参照文献[11]方法提取总黄酮。以龙血素B为对照品，使用分光光度法[11]测定精制后提取物黄酮含量为(54.30±2.38)%。

参考文献[12]介绍的方法，采用超高液相色谱法对DCF进行分析，色谱柱：ACQUTY UPLC C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流动相为乙腈(A)-水(B)梯度洗脱，线性洗脱程序为0～3 min，10%→18% A，3～15 min，18%→60% A，15～20 min，60%→90% A；流速0.3 mL·min-1；检测波长210 nm；柱温40 ℃；进样量3 μL。共得到28个色谱峰，经过标准品对照，其中1，3，13，14，24号峰分别为白藜芦醇、7，4’-二羟基黄酮、龙血素A、龙血素B、紫檀芪。见图1。

1.3.2细胞培养 H9c2细胞用含10%胎牛血清，1%双抗的高糖DMEM培养基，37 ℃、5%二氧化碳培养箱中培养，2 d 更换培养液，4 d 传代一次。

1.3.3CCK-8法测定DCF对H9c2心肌细胞毒性作用和H9c2心肌细胞缺氧复氧模型的干预作用 H9c2心肌细胞经0.25%胰蛋白酶消化收集，按每孔8000 个细胞接种于96孔培养板，置于37 ℃、5%二氧化碳培养箱中孵育24 h后，加入DCF，使其终浓度为100，50，25，12.5，6.25，3.125 μg·mL-1，每种浓度3个复孔。培养24 h后，取出96孔板吸出含药培养基每孔加CCK-8溶液10 μL，DMEM培养基90 μL，置于37 ℃孵育4 h后，测定波长450 nm处的吸光度。

H9c2心肌细胞以2.5×104·mL-1接种到96孔板中，每孔200 μL。培养24 h后，对H9c2心肌细胞进行如下分组：正常对照组和模型对照组，加入DMEM培养基；DCF大、中、小剂量组(20， 10， 5 μg·mL-1)，每组6个复孔，给药预处理24 h。吸出含药培养基更换为无血清无糖DMEM培养基，缺氧4 h后，进行复氧处理，复氧16 h，CCK-8法检测细胞存活率。

A.剑叶龙血树提取物；B.白藜芦醇对照品；C.7,4'-二羟基黄酮对照组；D.龙血素A对照品；E.龙血素B对照品；F.紫檀芪对照品；1.白藜芦醇；3.7,4'-二羟基黄酮；13.龙血素A；14.龙血素B；24.紫檀芪

图16种溶液的HPLC图

A.Dracaenacochinchinensis(Lour) S.C. Chen extract；B.reference substance of resveratrol；C.reference substance of 7,4'-dihydroxy flavonoids；D.reference substance of loureirin A；E.reference substance of loureirin B；F.reference substance of pterostilbene；1.resveratrol；3.7,4'-dihydroxy flavonoids；13.loureirin A；14.loureirin B；24.pterostilbene

Fig.1HPLCchromatogramofsixkindsofsolution

1.3.4流式细胞仪检测DCF对H9c2心肌细胞缺氧复氧模型的干预作用 H9c2心肌细胞以10×104·mL-1接种到6 mm培养皿中，每孔接种800 μL，按照“1.3.3”项中进行药物预处理并建立缺氧复氧损伤模型。用胰酶消化细胞，300×g离心10 min后，弃去上清液，加入磷酸盐缓冲液(PBS)清洗2次，离心去上清液，加1×Annexin-binding Buffer 100 μL 重悬细胞，并加入Annexin V 5 μL和PI工作液1 μL室温避光孵育20 min，再加入 Annexin-binding Buffer400 μL混匀，置冰盒内保存，于流式细胞仪中检测。

1.3.5Western blotting法测定DCF对缺氧复氧模型H9c2心肌细胞凋亡蛋白表达的影响 经过药物预处理的缺氧复氧H9c2细胞使用胰酶消化收集后，4 ℃预冷PBS清洗2次，加细胞裂解液99 μL和蛋白酶抑制剂1 μL混合液，冰浴上反应20 min，18 000×g离心15 min，取上清液使用BCA法定量后，按1：4加Loading Buffer混匀沸水浴5 min后于-80 ℃冻存待测。

蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，湿转法至硝酸纤维素膜上，再置封闭液中室温振摇2 h，分别加入鼠多克隆抗体Akt、β-actin、caspase-3和Bcl-2、Bax、PI3k、caspase-8抗体于4 ℃孵育过夜，TBST漂洗10 min×3次，二抗为用HRP标记的羊抗鼠、羊抗兔 IgG 抗体(1：5000)， 室温振摇孵育1 h，漂洗后用ECL显色，室温孵育3 min，曝光摄像，并计算灰度值。

2 结果

2.1DCF对H9c2心肌细胞毒性作用及缺氧复氧模型的保护作用 加入DCF 24 h后，利用CCK-8法测定细胞存活率，结果100，50，25，12.5，6.25，3.125 μg·mL-1DCF组H9c2细胞相对存活率分别为(26.02±2.21)%，(85.78±13.88)%，(92.25±9.99)%，(94.62±4.54)%，(104.20±4.94)%，(99.46±10.70)%;正常对照组H9c2细胞存活率(100.00±6.99)%。100 μg·mL-1DCF对H9c2细胞表现出一定的毒性作用，与正常对照组比较，差异有统计学意义(q=10.66，P<0.01)，IC50拟合结果为77.05 μg·mL-1(R2=0.9121)。

进行缺氧复氧处理后，20，10，5 μg·mL-1DCF组 H9c2细胞的相对存活率分别为(35.10±1.52)%，(44.70±2.27)%，(51.09±3.61)%，正常对照组和模型对照组 H9c2细胞存活率分别为(100.00±6.40)%，(33.41±1.24)%。模型对照组细胞存活率明显低于正常对照组(q=32.50，P<0.01)，10，5 μg·mL-1DCF可以增加缺氧复氧模型心肌细胞的存活率，与模型对照组比较，差异有统计学意义(q=5.506，8.626，P<0.01)。

2.2流式细胞术测定各组细胞凋亡 给药预处理24 h，更换无血清无糖培养基缺氧4 h复氧16 h处理，按照说明书方法进行流式细胞术检测，结果见图2。

缺氧复氧处理后模型对照组细胞凋亡率为(42.4±1.68)%，DCF中、小剂量组细胞凋亡率分别为(34.1±1.98)%，(29.4±2.63)%，并且中晚凋亡象限下细胞数也有明显减少，因此可推断其作用机制可能是抑制早凋亡及晚凋亡因子的生成。

2.3Western blotting测定凋亡蛋白表达 给药后进行缺氧复氧处理，处理结束后提取蛋白，进行Western blotting测定，结果见表1。

A.正常对照组；B.模型对照组；C.DCF大剂量组；D.DCF中剂量组；E.DCF小剂量组；与模型对照组比较，*1P<0.01

A.normal control group；B.model control group；C.high-dose DCF group；D.medium-dose DCF group；E.low- dose DCF group；compared with model control group,*1P<0.01

Fig.2EffectofDCFonapoptosisofH9c2cardiacmyocytes

表15组H9c2心肌细胞缺氧复氧处理后的凋亡蛋白表达

组别caspase-8/β-actincaspase-3/β-actinBcl-2/β-actinBax/β-actinAkt/β-actinPI3k/β-actin正常对照组1.156±0.198*10.691±0.078*11.134±0.150*21.185±0.210*20.519±0.0670.749±0.084*2模型对照组2.104±0.1701.098±0.1100.600±0.0632.473±0.3100.338±0.0490.350±0.042DCF 大剂量组2.292±0.3471.496±0.241*11.379±0.170*21.460±0.200*20.244±0.0370.871±0.096*2 中剂量组1.823±0.1600.603±0.079*10.631±0.0730.676±0.073*20.941±0.097*21.123±0.142*2 小剂量组1.579±0.140*21.460±0.2160.631±0.0691.058±0.190*22.092±0.240*21.429±0.162*2

与模型对照组比较，*1P<0.05，*2P<0.01

Compared with model control group，*1P<0.05，*2P<0.01

通过缺氧复氧处理后，模型对照组与正常组比较，蛋白表达量差异有统计学意义，而给予DCF后，DCF中剂量组及小剂量组能够显著上调PI3K及Akt蛋白表达，DCF大、中、小剂量组能够显著下调Bax蛋白表达，DCF大剂量组能够显著上调Bcl-2蛋白表达，而DCF中剂量只能显著下调Cleaved Caspase-3蛋白表达，DCF小剂量组能够显著下调Cleaved Caspase-8蛋白表达。

3 讨论

H9c2心肌细胞是20世纪70年代由KIMES等[13]从胚胎期BDIX大鼠心脏组织中分离得到的一种具有骨骼肌特性的心肌细胞株，与原代心肌细胞相比具有可分裂、传代培养等优点，是体外研究心血管疾病药效及作用靶点的最主要材料。本研究利用缺氧复氧处理H9c2心肌细胞模拟心肌缺血-再灌注损伤模型，能够较为真实反映DCF的作用机制。

本研究中剑叶龙血树黄酮类成分提取率较高，比对文献[14]，龙血竭中主要成分如龙血素A、龙血素B、白藜芦醇、紫檀芪等均在剑叶龙血树黄酮中得到，且剑叶龙血树黄酮含量要高于龙血竭药材中总黄酮含量，这也为剑叶龙血树黄酮的产品开发及深入研究其作用机制提供了依据。

本研究结果显示，DCF中、小剂量组对缺氧复氧处理H9c2心肌细胞具有较好的保护作用，其作用机制可能是通过上调PI3K、Akt蛋白表达，下调Bax、Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-8等蛋白的表达相关，这可能与白藜芦醇、紫檀芪等成分植物雌激素样作用相关[15-16]。同时，实验结果表明，DCF与凋亡蛋白的表达并不存在严格的剂量依赖关系，中剂量组降低Cleaved Caspase-3蛋白表达更为明显，小剂量组下调Cleaved Caspase-8蛋白表达更为明显，而大剂量组能够显著上调Bcl-2蛋白表达，这可能是由DCF中不同化合物活性差异引起，有待进一步验证，DCF成分与作用机制间的关系将是后期研究的重点。