盐度和干露对大竹蛏呼吸代谢相关酶的影响

李东东，聂鸿涛，刘国龙，闫喜武

( 1.大连海洋大学，水产与生命学院，辽宁 大连 116023; 2.大连海洋大学，辽宁省贝类良种繁育工程技术研究中心，辽宁 大连 116023 )

大竹蛏(Solengrandis)属软体动物门、瓣鳃纲、帘蛤目、竹蛏科，广泛分布于我国沿海地区，生活在潮间带至20 m深的浅海，是重要的海产经济贝类[1]。大竹蛏营埋栖生活，以海水中微型浮游生物和有机碎屑为食[2]。大竹蛏个体大、味道鲜美、营养极其丰富。我国海水养殖贝类技术发展日益精进，生物学家越来越重视贝类遗传育种以及贝类保护的研究[3]。但近年来，海域环境污染严重和过度捕捞等原因导致大竹蛏的现存资源量越来越少，因此，大竹蛏的人工规模养殖对保护和恢复大竹蛏资源有重要意义。

盐度、干露是水产养殖中比较重要的两个非生物因子，影响着水生生物的生理及存活。聂鸿涛等[4]研究表明，盐度对大竹蛏耗氧率和排氨率具有较大的影响。高杉等[5]研究表明，盐度突变至15和35后，大竹蛏稚贝会长期处于氧化应激状态，且大竹蛏稚贝培育的最适盐度为20～30。陈爱华等[6]研究表明，盐度对大竹蛏稚贝的生长及存活有较大影响，大竹蛏稚贝最适宜存活的盐度为20～32，盐度20时，成活率最大，为85%；最适生长的盐度为20～28，盐度24时，大竹蛏稚贝日生长率最大，为1.72%。盐度突变不仅可以影响免疫因子使机体的免疫能力下降，还可以通过改变蛋白质的结构来影响机体的免疫能力。张鹭等[7]指出，缢蛏(Sinonovaculacomstricata)在低盐条件下，血淋巴中磷脂酶A2和锌指蛋白等6种蛋白会发生改变，导致缢蛏的死亡率显著增加。近年来，关于干露条件对贝类影响的研究在长牡蛎(Crassostreagigas)[8]、墨西哥湾扇贝(Argopectenirradiansconcentricus)幼虫和稚贝[9]、毛蚶(Scapharcasubcrenata)幼苗[10]、菲律宾蛤仔(Ruditapesphilippinarum)幼虫[11]等中均有报道。长牡蛎成贝的耐干露能力较其稚贝强，并且在低温条件下干露成活率显著高于高温[8]。

呼吸代谢是直接反应生物机体能量代谢的基本生理活动，不仅能反映生物体代谢特征、生理状态及营养情况，还能反应环境条件对生物生理活动的影响程度，是水生动物生理学研究的重要内容之一[12-13]。水产动物呼吸代谢类型主要为有氧方式，但在低氧条件下也可通过无氧呼吸代谢方式为机体提供能量[14]。乳酸脱氢酶是生物机体无氧条件下糖酵解过程中参与调节的重要酶类，其活性可以用来反映无氧呼吸代谢能力[15]。琥珀酸脱氢酶是有氧代谢的首要酶类和衡量指标，在三羧酸循环中起到连接氧化磷酸化与电子传递的作用，为细胞线粒体需氧和产能的呼吸链提供电子[13]。在机体代谢中，碱性磷酸酶发挥着重要作用，当碱性磷酸酶活性降低后，生物体的免疫和代谢能力均会受到影响[16]。

在大竹蛏的养殖中，大竹蛏对环境的适应能力受诸多环境因子的影响,其中盐度和干露是两个重要的环境因子，对大竹蛏的呼吸、代谢、生长和免疫等有着十分重要的作用[17-19]。消化腺是软体动物消化和代谢的中心，在贝类消化腺中代谢酶活性处于较高水平[20]。目前，大竹蛏人工育苗、遗传多样性等方面的研究已有报道[21-23]，但鲜见盐度和干露对其影响的相关研究。笔者以大竹蛏消化腺中呼吸代谢酶活性变化作为指标，来反应盐度和干露胁迫对大竹蛏呼吸代谢功能的影响，旨在为大竹蛏的人工规模化养殖、育成、运输提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用大竹蛏取自大连湾海域，壳长(9.16±0.5) cm,壳宽(1.54±0.38) cm,壳高(1.52±0.5) cm，湿质量(41.85±0.88) g。在50 cm×30 cm×35 cm的水槽内适应性暂养7 d。暂养期间，海水盐度30±1，水温(14±1) ℃，持续充氧，日换水1次；定时投喂螺旋藻(Spirulina)粉，日投喂2次，试验前2 d停止投饵。

1.2 试验方法

1.2.1 胁迫试验

相同试验条件下，试验设置盐度胁迫和干露胁迫两组。

盐度胁迫：暂养结束后，将大竹蛏随机分为5组，以每个水槽30个的密度将大竹蛏置于5个盐度梯度(15、20、25、30、35盐度组，30作为对照组)的水槽中，每个水槽中水温24～26 ℃，pH 8.1～8.3。低盐度的调节是使用经过曝气处理的自来水加入到海水中调节，盐度35高盐调节是将盐水精加入到海水中调节。每个处理3个平行，均在相同条件下胁迫10 d。胁迫时日换水1次、投饵2次，持续充气。

干露胁迫：胁迫前挑选经驯化7 d后活性良好

的大竹蛏，设置4个处理组，放入水槽中，水槽底部铺满过滤海水浸湿过的沙子，厚10 cm。每个胁迫时间组设3个平行，每个平行放30个大竹蛏。分别于室温条件下干露6、12、24、48 h，每个水槽中各取3个大竹蛏的消化腺用于试验分析。对照组在相同条件下养殖。

1.2.2 样品处理

盐度胁迫试验和干露胁迫试验每个平行组取3个大竹蛏样品。将胁迫后的大竹蛏置于冰盘上迅速解剖，每个个体取消化腺0.2～0.4 g，放入预冷的匀浆器中，加入4倍体积预冷的0.9%生理盐水，制备成组织匀浆液，于高速冷冻离心机中4 ℃、4000 r/min，离心10 min，取上清液用于酶活性检测。

1.3 蛋白含量和呼吸代谢酶活性的测定

乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、琥珀酸脱氢酶活性用微量酶标法测定，总蛋白含量用考马斯亮蓝法测定。以上指标均采用南京建成生物工程研究所的试剂盒测定，具体测定方法严格按照试剂盒内说明书进行。乳酸脱氢酶活力单位定义为：37 ℃反应条件下，每克组织蛋白与基质反应15 min，反应体系中生成1 μL丙酮酸为1个酶活力单位(U)；琥珀酸脱氢酶活力单位定义为：37 ℃ 条件下，每毫克蛋白每分钟使反应体系的吸光值降低0.01为1个酶活力单位(U)；碱性磷酸酶活力单位定义为：37 ℃条件下，每克组织蛋白与基质作用15 min产生1 mg酚为1个酶活力单位(U)。

1.4 试验数据处理与分析

所得试验数据均用平均值±标准差表示。采用Microsoft Excel和SPSS统计软件进行单因素方差分析及Duncan多重比较，以P<0.05作为差异显著。

2 结果与分析

2.1 盐度和干露对大竹蛏碱性磷酸酶活力的影响

盐度逐步升高时，大竹蛏消化腺碱性磷酸酶活力随时间变化见图1，大竹蛏碱性磷酸酶活性随盐度的升高呈先降后升的变化趋势。盐度20时，大竹蛏碱性磷酸酶活性最低，为0.043 U/g，且显著低于其他各组(P<0.05)；而后逐渐恢复，盐度25、30和35时，大竹蛏碱性磷酸酶活力变化不显著(P>0.05)，盐度25时，大竹蛏碱性磷酸酶活力处于较高水平，为0.053 U/g，显著高于盐度35时的活力(P<0.05)。

图1 盐度对大竹蛏消化腺碱性磷酸酶活力的影响相同小写字母表示组间差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示组间差异显著(P<0.05)，下同.

干露时间对大竹蛏碱性磷酸酶活性的变化见图2。随着干露时间的延长，大竹蛏消化腺中碱性磷酸酶活性随着干露时间的增加而降低，各组碱性磷酸酶活力变化无显著差异(P>0.05)。干露6 h时碱性磷酸酶活力最高，为0.042 U/g，干露48 h时碱性磷酸酶活力最低，为0.020 U/g。

2.2 盐度和干露对大竹蛏琥珀酸脱氢酶活力的影响

在盐度胁迫下，各个盐度组的大竹蛏消化腺琥珀酸脱氢酶活力变化见图3。随着盐度的变化，消化腺琥珀酸脱氢酶活力出现了先降后升最后恢复的变化，盐度20组琥珀酸脱氢酶活力降低，与对照组相比差异不显著(P>0.05)，盐度25组的琥珀酸脱氢酶变化明显，显著升高(P<0.05)，为0.401 U/mg，高于对照组，但差异不显著(P>0.05)，盐度15组和盐度35组与对照组差异不显著(P>0.05)。

不同干露时间胁迫下，大竹蛏琥珀酸脱氢酶活性变化见图4，随着干露时间的延长，消化腺中琥珀酸脱氢酶活性变化显著(P>0.05)，干露胁迫6、12、24 h，琥珀酸脱氢酶活性显著高于48 h时的活性，且随着胁迫时间的延长，酶活性呈降低的趋势(P>0.05)，48 h达到最低，为0.197 U/mg。其中，干露胁迫6 h时琥珀酸脱氢酶活性为0.538 U/mg，且显著高于12 h时的活性(P<0.05)；干露胁迫12 h时和24 h时琥珀酸脱氢酶活性分别为0.302 U/mg和0.311 U/mg，显著高于48 h时的活性(P>0.05)。

图3 盐度对大竹蛏消化腺琥珀酸脱氢酶活力的影响

图4 干露时间对大竹蛏消化腺琥珀酸脱氢酶活力的影响

2.3 盐度和干露对大竹蛏乳酸脱氢酶活力的影响

随着盐度的增加，大竹蛏消化腺乳酸脱氢酶活性变化见图5。乳酸脱氢酶活力出现先降后升再恢复的变化。盐度20时，乳酸脱氢酶活力为0.287 U/g，显著低于盐度15时的活力(0.437 U/g)(P>0.05)。盐度25时，乳酸脱氢酶活力为0.604 U/g，显著高于盐度15时的活力(P<0.05)。盐度30、35时，乳酸脱氢酶活力呈波动变化，但差异不显著(P>0.05)。

干露胁迫下，大竹蛏消化腺乳酸脱氢酶活力随时间变化见图6。干露胁迫6 h时与0、12、24 h时大竹蛏消化腺的乳酸脱氢酶活力差异不显著(P>0.05)，但干露胁迫48 h时大竹蛏消化腺的乳酸脱氢酶活性(0.187 U/g)明显降低，显著低于干露胁迫0、6、12 h和24 h时的活性(P<0.05)。

图5 盐度对大竹蛏消化腺乳酸脱氢酶活力的影响

图6 干露时间对大竹蛏消化腺乳酸脱氢酶活力的影响

3 讨 论

3.1 盐度对大竹蛏呼吸代谢酶活力的影响

乳酸脱氢酶是调节机体糖代谢中无氧代谢酶之一，乳酸脱氢酶将糖酵解产生的丙酮酸还原成乳酸，才能使糖酵解顺利进行[24]，所以能使机体糖酵解正常运行的前提条件是乳酸脱氢酶保持其活性[25]。乳酸脱氢酶与细胞代谢活动密切相关，是糖酵解与三羧酸循环之间的关键酶，其活力大小在一定程度上反映了无氧条件下生物代谢能力的强弱[26]，可作为衡量无氧代谢水平的指标之一。本试验结果表明，当盐度为25时，大竹蛏乳酸脱氢酶活力较高，说明在靠近等渗点的环境中，机体内无氧代谢水平较高，有助于为大竹蛏的运动提供能量保障。随着内外渗透梯度的增大，大竹蛏乳酸脱氢酶活力下降，无氧代谢水平降低，使得进入三羧酸循环的丙酮酸含量增加，三羧酸循环速度加快，从而为机体提供更多的能量以适应环境的变化，琥珀酸脱氢酶活力的变化也证明了这一点。

碱性磷酸酶是参与生物体代谢调控的重要酶类，直接参与磷酸基团的转移，钙代谢等，对于细胞调节和营养物质的消化、吸收具有重要作用,是评价生物体生长和免疫的重要指标[27-28]。本试验结果表明，盐度20时大竹蛏的碱性磷酸酶的活性显著低于盐度15、25、30、35时的活性，且当高盐度胁迫时大竹蛏碱性磷酸酶的活力显著低于对照组的活力(P<0.05)。这说明盐度为20、35时，对大竹蛏碱性磷酸酶活性的影响较大，且低盐度的影响显著高于高盐度的影响。王瑞芳等[28]的研究表明，中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)的碱性磷酸酶活性在高盐度(35)时显著低于在低盐度(28)时，且碱性磷酸酶活性随盐度的升高而降低。本试验的结果与其不同，可能与物种的不同有关。本试验结果还显示，碱性磷酸酶活力在盐度25时最高，但与对照组差异不显著(P>0.05)，后随盐度增加其活性逐步下降，表现出了碱性磷酸酶的滞后性，这与中国血蛤(Hiatulachinensis)在低盐度下免疫反应迟缓的结果一致[29]，可能是由于低盐下某些特异性因子受到抑制所致[28]。综上可知，盐度25接近大竹蛏碱性磷酸酶活性随盐度变化的临界值。

琥珀酸脱氢酶参与氧化磷酸化作用和三羧酸循环，是呼吸链中的第一个酶，在进行有氧呼吸时，琥珀酸脱氢酶在三羧酸循环中将延胡索酸还原成琥珀酸，为机体提供能量，从而其活力可在一定程度上反应有氧代谢的水平[30]。在本试验中，琥珀酸脱氢酶活性的变化呈“W”型。从整体变化来看，大竹蛏的最适盐度为25～35，且当盐度为25时，酶活性达到最高，琥珀酸脱氢酶活力较高，说明此时大竹蛏机体的有氧代谢水平最高。本试验中不同盐度下，琥珀酸脱氢酶活力差异的消除也可能与长时间的盐度驯化有关。随着大竹蛏的在胁迫盐度下的适应，其自身的有氧呼吸代谢能力增强，琥珀酸脱氢酶活力增高。

3.2 干露对大竹蛏呼吸代谢酶活力的影响

海产经济贝类在养殖和运输中会遭受干露胁迫，干露时间决定胁迫强度。当贝类离开水环境后，需要维持自身的生命力，但是由于缺水后不能进行正常的呼吸作用，会导致贝类窒息死亡。贝类对干露胁迫的耐受能力与干露时间的长短、规格的差异、物种的不同均有一定的关系，且与时间、温度成负相关；相同物种中，由于成贝的软体部比稚贝大，体内含水量相对较多，成贝比稚贝具有更强的耐干露能力，成活率高[8]。

大竹蛏生活在潮间带到20 m水深的浅海，埋栖在深度30～40 cm的泥滩或沙滩中。在自然界中，除了受到温度、盐度和其他环境条件的影响外，由于四季变换、环境突变等，大竹蛏也会受到不同程度干露的胁迫，自身的呼吸代谢酶活力会受到影响[1]。通过测定不同干露时间下碱性磷酸酶、琥珀酸脱氢酶和乳酸脱氢酶的活性，掌握干露时间对大竹蛏呼吸代谢酶活力的变化规律，从而探明干露对大竹蛏耐受能力的影响。在缺氧或者动物机体本身代谢过于旺盛但氧气供应不足的环境条件下，机体能量的供应主要通过糖酵解作用，碱性磷酸酶对糖酵解也有着重要作用[24]。碱性磷酸酶是溶酶体中重要的溶解酶，直接参与体内磷酸基团的转移和代谢，与一些营养物质的消化和吸收相关[31]。本试验结果显示，随着干露时间的延长，3种酶的活力呈现逐渐下降的变化趋势。随着干露时间的延长，琥珀酸脱氢酶的活力逐渐降低，当干露时间超过24 h后，下降愈发明显，表明随着干露时间延长，大竹蛏的有氧代谢水平逐渐降低。随着干露时间延长，乳酸脱氢酶活力呈现总体下降趋势，但当干露时间延长至24 h，其活性较12 h时略有上升。随着干露时间延长，大竹蛏的琥珀酸脱氢酶和乳酸脱氢酶活力均呈先降低后平稳再下降的变化趋势，但差异不显著(P>0.05)。表明干露胁迫24 h后，大竹蛏机体仍具有自我修复能力，但长时间的干露必然会损伤大竹蛏的代谢能力，与段亚飞等[32]的研究结果一致。随着干露时间的延长，碱性磷酸酶活力呈持续下降趋势，各梯度下的酶活力差异显著(P<0.05)。试验结果表明，大竹蛏耐干露的时间范围在24 h以内，超出这一范围，其存活率和酶活力均出现不可逆的急剧下降。