两份玉米CMS-C恢复系的育性恢复力测定及恢复基因的分子标记定位

牟碧涛 赵卓凡 岳 灵 李 川 张 钧 李章波 申 汉曹墨菊,*



两份玉米CMS-C恢复系的育性恢复力测定及恢复基因的分子标记定位

牟碧涛1,2赵卓凡1岳 灵1李 川1张 钧3李章波3申 汉3曹墨菊1,*

1四川农业大学玉米研究所/ 农业部西南玉米生物学与遗传育种重点实验室, 四川成都 611130;2宜宾市农业科学院食用菌蚕桑研究所, 四川宜宾 644000;3内蒙古真金种业科技有限公司, 内蒙古鄂尔多斯 014300

为了发掘更多玉米C型不育胞质的强恢复系资源, 本研究对2份自交系Z16和7250-14-1进行了恢复能力的测定、恢复基因的遗传分析及恢复基因的分子标记定位。结果表明, Z16和7250-14-1对C黄早四、C478、C698-3和CMo17均表现为育性恢复, 而对C48-2则均表现为育性部分恢复。通过对玉米CMS-C不同亚组胞质测交鉴定发现, Z16对G48-2、EC48-2、ES48-2、RB48-2及类48-2均表现为不育性保持, 而7250-14-1对G48-2、EC48-2、ES48-2表现为育性部分恢复, 对RB48-2和类48-2则表现为不育性保持。Z16和7250-14-1对CMS-T不育系均表现为不育性保持, 而对CMS-S不育系则均表现为育性部分恢复。遗传分析显示, Z16对C478和C黄早四的育性恢复均受1对基因控制; 而7250-14-1对C黄早四及C478的育性恢复分别受1对基因及2对基因控制。利用(C黄早四×Z16)F2、(C黄早四×7250-14-1)F2群体分别对恢复基因进行分子标记定位, 其中Z16的恢复基因被定位于标记B-1至第8染色体短臂末端区域, 物理距离为494 kb; 7250-14-1的恢复基因被定位于第8染色体短臂的标记B-1和Chr8-86080之间, 物理距离为249 kb。该研究不仅为玉米CMS-C“三系”配套的生产利用提供了恢复基因资源, 也为玉米CMS-C恢复基因的克隆及恢复机制的研究奠定了一定基础。

玉米; 细胞质雄性不育; 恢复基因; 分子标记定位

细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility, CMS)作为“三系”配套杂交制种的重要工具, 在杂交种子的生产以及杂种优势利用上具有重要应用价值。根据恢复专效性, 可将玉米雄性不育胞质分为C型(CMS-C)、T型(CMS-T)和S型(CMS-S) 3种类型[1]。Pring等[2]根据线粒体基因组的酶切图谱将C型胞质分为CI (C)、CII (RB、BB及E)和CIII (ES) 3个亚组。而对于恢复基因(restorer gene,)及恢复系的研究既有助于CMS的不育化制种应用, 也有助于对育性恢复机制的探究。迄今, 国内外学者对玉米细胞质雄性不育的育性恢复进行了大量研究, CMS-T的育性恢复由基因和控制, Duvick等[3]将定位于玉米第3染色体短臂上, Snyder等[4]将定位于玉米第9染色体靠近基因座位的附近区域。Wise等[5]的进一步研究将定位于第3染色体的umc97与umc92之间, 距离umc97为1.1 cM, 将定位在距离umc153为3.8 cM的位点上, Cui等[6]利用转座子标签法成功克隆得到基因。CMS-S的恢复主基因为, Zhang等[7]利用AFLP、SCAR标记将定位在第2染色体的长臂上, 位于标记E7P6与E12M7之间, 遗传距离分别为0.9 cM和1.8 cM。李鹏等[8]利用BC1F1同质群体将精细定位在第2染色体的长臂上, 位于SSR标记A165与CG2之间, 两标记的物理距离为1.4 Mb。此外, Feng等[9]通过全基因组关联分析发现, 除主效恢复基因外, 在染色体的其他位置上还有近30个位点与CMS-S的育性恢复有关。CMS-C的育性恢复机制较为复杂, Kheyr-Pour等[10]研究表明, C型细胞质雄性不育的育性恢复受显性基因控制; 陈伟程等[11]则认为, C型不育系的育性恢复受2对具有重叠效应的基因控制; Vidakovic等[12-14]提出, 玉米CMS-C的育性恢复可能受3对甚至更多的互补基因控制。Sisco等[15]利用RFLP标记将玉米自交系A619中的恢复基因定位在玉米第8染色体的短臂上, 与RFLP标记Npi114a连锁; 汤继华等[16]利用SSR标记同样将A619的恢复基因定位于玉米第8染色体的短臂, 与SSR标记bnlg2307的遗传距离为12.3 cM, 同时通过对玉米自交系凤可1号的研究, 将恢复基因定位在玉米第5染色体上, 与SSR标记bnlg1346、phi058、bnlg1711连锁, 遗传距离分别为1.68 cM、9.87 cM、7.51 cM。此外, Kohls等[17]通过对玉米C型不育系B37C与恢复系K55的研究, 分别在bin 2.09、bin 3.06和bin 7.03 3个染色体区段上检测到控制CMS-C育性部分恢复基因的主效QTL。

S型不育系属于配子体不育, 败育时期晚, 育性不稳定[18-19], 一定程度上阻碍其在生产上的利用; T型不育系属于孢子体不育, 败育时期早, 败育彻底, 但由于玉米小斑病T小种的专化侵染, 致使T型不育系的利用被迫停止[20]; 作为孢子体不育的C型不育系不仅败育早, 且败育彻底[21], 长期以来受到育种家的广泛关注, 但目前生产上因缺乏对CMS-C具有强恢复力的恢复系, 致使CMS-C的生产利用受到限制, 因此发掘、鉴定玉米CMS-C新恢复源并对其进行基因定位及克隆研究无疑具有十分重要的意义。本课题组在前期的研究中发现玉米自交系Z16、7250-14-1对C黄早四和C478表现为育性完全恢复, 因此本研究一方面通过广泛测交鉴定2份自交系的恢复力; 另一方面通过杂交、自交结合回交进行恢复基因的遗传分析, 同时利用F2群体进行恢复基因的分子标记定位, 为2份自交系在不育化制种中的生产利用及恢复基因的克隆提供重要参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以同质异核、同核异质的CMS-C不育系以及CMS-T、CMS-S不育系为母本(表1), 分别与玉米自交系Z16、7250-14-1 (由内蒙古真金种业科技有限公司提供)杂交得到F1, 用于恢保关系的测定。以不育系C黄早四、C478为母本, 自交系Z16、7250-14-1为父本, 构建相应的F2群体; 同时以黄早四、478作为轮回亲本与F1回交, 得到相应的回交群体BC1。所有F2和BC1群体用于遗传分析, (C黄早四×Z16)F2和(C黄早四×7250-14-1)F2作为基因定位群体。

表1 玉米同核异质、同质异核不育系

1.2 育性鉴定

采用Duvick 5级分类标准鉴定育性[22]。对所有实验材料单株挂牌, 严格按照Duvick的方法逐株进行育性调查, 调查时间为植株整个散粉期, 每隔1 d调查1次, 每株至少调查3次; 采用I2-IK染色法, 于植株散粉期, 在每株雄穗主穗的上、中、下3个部位分别取1对小穗, 用固定液FAA固定, 进行花粉镜检。

1.3 恢复基因的遗传分析

于不同年份不同地点种植F2、BC1群体, 统计各群体中可育株与不育株的分离比例, 并进行卡方检验。

1.4 恢复基因的分子标记定位

采用CTAB法[23]提取叶片总DNA, 从F2分离群体中随机选取10株完全可育株和10株完全不育株, 等量混合其DNA, 分别构建可育基因池和不育基因池, 参照网站https://www.maizegdb.org/上的引物序列信息以及Qu等[24]设计的InDel引物信息, 由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物。利用分布于玉米10条染色体上的1062对SSR引物及29对InDel引物在亲本间进行多态性引物筛选, 然后经混合群体分离分析法(bulked segregant analysis, BSA)对筛选到的多态性引物进一步筛选, 最后利用获得的多态性引物对F2群体的完全不育单株进行基因分型, 寻找与目的基因连锁的分子标记。

基于初步定位的结果, 从https://www.maizegdb. org/网站上下载定位区间内DNA序列信息, 用SSRHUNTER搜索SSR位点, 在https://www.ncbi.nlm. nih.gov/上设计SSR引物; 同时, 根据亲本间的DNA序列差异, 利用Oligo 7设计InDel引物, 并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。扩大F2群体, 利用新开发的多态性标记及初定位的分子标记对F2群体的所有完全不育单株进行基因分型。PCR体系为15 µL, 包括7.5 µL2×PCR Master Mix (由成都擎科梓熙生物技术有限公司提供)、1.5 µLDNA模板、5.0 µLddH2O、10 µmol L–1前后引物各0.5µL。PCR反应程序为95℃5 min; 95℃50 s, 57℃ 30 s, 72℃40 s, 35个循环; 72℃ 10 min。PCR产物经6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳, 银染后, 观察记录扩增条带并拍照。

1.5 遗传连锁图谱构建

选取F2群体中完全不育单株的分离单株为作图群体, 将与母本带型一致的单株记为A, 与父本带型一致的单株记为B, 杂合带型的单株记为H。利用Kosambi函数将重组率转化为遗传距离[25], 利用MapMaker 3.0进行连锁数据分析, 绘制遗传图谱。

2 结果与分析

2.1 恢保关系测定

以同质异核、同核异质的CMS-C不育系以及CMS-T、CMS-S不育系为母本, 自交系Z16、7250-14-1为父本, 分别测交, 2017年夏季, 将所有测交组合种植于四川温江, 每个组合2行, 每行14株, 对所有测交F1进行育性鉴定, 部分测交组合的雄穗育性表现及花粉染色情况如图1。

2.1.1 自交系Z16的恢保关系测定 将同质异核及同核异质的CMS-C不育系与Z16测交后代的育性鉴定结果列入表2, 由表2可知, Z16对CMo17、C698-3、C黄早四、C478均表现为育性恢复, 各测交组合的雄穗育性等级均为V级, 且花粉可染率高达96.7%以上, 说明育性恢复比较彻底。组合C48-2×Z16的雄穗育性等级除少数为II级外, 大多数为III级, 同时花粉可染率也仅为39.0%, 说明Z16对C48-2表现为育性部分恢复。此外, 所有CMS-C亚组胞质测交组合的雄穗育性等级均为I级, 其中组合G48-2×Z16、EC48-2×Z16能产生不可染的花粉, 而组合ES48-2×Z16、RB48-2×Z16以及类48-2×Z16为无花粉型, 即不能产生花粉。说明Z16对48-2核背景下的C胞质其他亚组胞质均不具有育性恢复能力。

由表3可知, Z16对TMo17、T698-3均表现为不育性保持, 测交组合均为无花粉型。测交组合SMo17×Z16的雄穗育性等级多为III级, 花粉可染率仅为22.0%; 而组合S698-3×Z16的雄穗育性等级为I级, 但花粉可染率达到29.2%, 表明Z16对CMS-S表现育性部分恢复。

图1 部分测交组合的育性表现

I: 花药不外露; II: 花药外露比例为0~25%; III: 花药外露比例为25%~50%; IV: 花药外露比例为50%~75%; V: 花药外露比例为75%~100%。

I: no emerged of anthers; II: from 0 to 25% anthers emerged; III: more than 25% to 50% anthers emerged; IV: more than 50% to 75% anthers emerged; V: more than 75% anthers emerged.

表2 CMS-C不育系与Z16测交后代的育性鉴定结果

I: 花药不外露; II: 花药外露比例为0~25%; III: 花药外露比例为25%~50%; IV: 花药外露比例为50%~75%; V: 花药外露比例为75%~100%。“-”代表无花粉。

I: no emerged of anthers; II: from 0 to 25% anthers emerged; III: more than 25% to 50% anthers emerged; IV: more than 50% to 75% anthers emerged; V: more than 75% anthers emerged. “-” denotes no pollen formed.

表3 CMS-T、CMS-S不育系与Z16测交后代的育性鉴定结果

2.1.2 自交系7250-14-1的恢保关系测定 由表4可知, 7250-14-1对CMo17、C698-3、C黄早四以及C478均表现为育性恢复, 各测交组合的雄穗育性等级均为V级, 且花粉可染率均超过91%, 说明恢复彻底; 而测交组合C48-2×7250-14-1的雄穗育性等级为III级, 花粉可染率高达83.3%, 说明7250-14-1对C48-2表现为育性部分恢复。同时, 7250-14-1对G48-2、EC48-2及ES48-2均表现为育性部分恢复, 虽然3个测交组合的雄穗育性等级均为III级, 但组合G48-2×7250-14-1、ES48-2×7250- 14-1的花粉可染率超过94%远高于组合EC48-2× 7250-14-1(22.6%)。7250-14-1对RB48-2和类48-2表现为不育性保持, 测交组合的雄穗育性等级均为I级, 且花粉均完全不可染。表明7250-14-1对48-2背景下不同亚组胞质的育性恢复能力不同。

由表5可知, 7250-14-1对TMo17、T698-3均表现为不育性保持, 且测交组合均为无花粉型。对SMo17、S698-3均表现为育性部分恢复, 测交组合的雄穗育性等级均为IV级, 其中组合S698-3× 7250-14-1的花粉可染率为43.9%, 而SMo17×7250- 14-1的花粉可染率仅为14.1%。

2.2 遗传分析

将不育系C黄早四、C478与恢复系Z16、7250-14-1组配的F2及BC1群体于2016—2017年分别在云南西双版纳(景洪)、四川温江及崇州进行育性鉴定, 育性调查结果见表6和表7。

由表6可知, (C黄早四×Z16)F2及[(C黄早四×Z16)×黄早四]群体中可育单株与不育单株的比例分别符合3∶1和1∶1 (>0.05), (C478×Z16)F2及[(C478×Z16)×478]群体中可育单株与不育单株的比例也分别符合3∶1和1∶1 (>0.05), 说明Z16对C黄早四和C478的育性恢复均受1对基因控制。

由表7可知, (C黄早四×7250-14-1)F2和[(C黄早四×7250-14-1)×黄早四]群体中可育单株与不育单株的比例分别符合3∶1和1∶1 (>0.05), 说明7250-14-1对C黄早四的育性恢复受1对基因控制;与此同时, (C478×7250-14-1)F2和[(C478×7250-14-1)×478]群体可育单株与不育单株的比例分别符合9∶7和1∶3 (>0.05), 说明7250-14-1对C478的育性恢复受2对基因控制, 且呈显性互补关系。

表4 CMS-C不育系与7250-14-1测交后代的育性鉴定结果

表5 CMS-T、CMS-S不育系与7250-14-1测交后代的育性鉴定结果

c2(0.05, 1)=3.84.

c2(0.05, 1)=3.84.

2.3 恢复基因的分子标记定位

2.3.1 自交系Z16恢复基因的分子标记定位 选用位于玉米10条染色体上的1062对SSR引物以及29对InDel引物, 对亲本C黄早四与Z16进行多态性分析, 共有404对引物在两亲本间呈现多态性。利用BSA法对筛选到的多态性引物进一步筛选, 发现位于第8染色体短臂上的InDel引物IDP8573、Chr8-1330080、TIDP5557、Chr8-86080在可育基因池与不育基因池之间呈现多态性(引物信息见附表1)。利用这些多态性引物对(C黄早四×Z16)F2群体中的156株完全不育单株进行基因分型发现, TIDP5557检测到4个交换单株, Chr8-86080未检测到交换单株, 因此初步将Z16的恢复基因定位于标记TIDP5557至第8染色体短臂末端的区域(图2)。基于初定位结果, 在标记TIDP5557至第8染色体短臂末端区域内新开发了4对分子标记(附表1), 利用新开发的分子标记以及初定位的连锁标记对(C黄早四×Z16)F2群体中的798株完全不育单株进行基因分型。结果发现, 标记B-1检测到2个交换单株, 而B-6-1、B-2以及Chr8-86080均未检测到交换单株, 于是将Z16的恢复基因定位于分子标记B-1至第8染色体短臂末端的区域, 该区域的物理范围为494 kb (图2)。

图2 自交系Z16所含Rf基因在第8染色体上的连锁图谱

2.3.2 自交系7250-14-1恢复基因的分子标记定位

选用位于玉米10条染色体上的1062对SSR引物和29对InDel引物在亲本C黄早四与7250-14-1之间进行多态性分析, 共有389对引物在两者间存在多态性。利用BSA法对筛选到的多态性引物进一步筛选发现, 位于第8染色体短臂上的InDel引物Chr8-1330080、IDP7866、IDP500、IDP8319、Chr8- 398180及Chr8-86080在可育基因池与不育基因池之间呈现多态性(引物信息见附表2)。利用这些多态性引物对(C黄早四×7250-14-1)F2群体中的143株完全不育单株进行基因分型发现, 引物IDP8319检测到1个交换单株, 而Chr8-398180、Chr8-86080均未检测到交换单株, 因此初步将7250-14-1的恢复基因定位于IDP8319至第8染色体短臂末端的区域(图3)。基于初定位结果, 在标记IDP8319至第8染色体短臂末端区域内新开发了4对分子标记(附表2), 利用新开发的分子标记以及初定位的连锁标记对(C黄早四×7250-14-1)F2群体中的432株完全不育单株进行基因分型。发现标记B-1检测到4个交换单株, Chr8-86080检测到1个交换单株, 且利用B-1和Chr8-86080检测到的交换单株不相同, 因此将7250-14-1的恢复基因定位于标记B-1与Chr8-86080之间, 物理距离为249 kb (图3)。

3 讨论

“三系”配套是植物细胞质雄性不育应用于不育化制种的前提。而其中恢复系的选育及恢复力的表现又直接关系到不育化制种的应用成效。本研究发现, Z16和7250-14-1除了对玉米CMS-C的CI亚组中的C48-2表现为部分恢复外, 对CI亚组的C478、C黄早四、C698-3等均表现为完全恢复。自交系A619是含有主效恢复基因的强恢复系, 它不仅对C478、C黄早四、C698-3表现为强恢复, 对C48-2也同样表现为强恢复[26]。可见, Z16和7250-14-1对CMS-C不育系的育性恢复能力不同于A619。通过对玉米CMS-C不同亚组胞质的恢保关系测定发现, Z16不能恢复RB48-2、ES48-2、G48-2、EC48-2、类48-2的育性; 7250-14-1能够部分恢复ES48-2、G48-2、EC48-2的育性, 但对RB48-2、类48-2则表现为不育性保持。从这个意义上来说Z16与7250-14-1对玉米CMS-C的育性恢复能力也存在差异。

图3 自交系7250-14-1所含Rf基因在第8染色体上的连锁图谱

本研究基于2个不育系背景下的F2及BC1群体的遗传分析发现, Z16对C黄早四和C478的育性恢复均受1对基因控制, 而7250-14-1对C黄早四的育性恢复受1对基因控制, 但对C478则表现为受2对基因控制。于是我们选择不育系C黄早四做母本, Z16及7250-14-1分别做父本, 配制F2作为基因定位群体, 分别对Z16及7250-14-1中的主效恢复基因进行分子标记定位。最终将Z16和7250-14-1的主效恢复基因均定位于第8染色体短臂末端, 且定位区间包含了候选基因[27]。2份自交系的定位区间存在较大的重叠区域, 参照B73序列(http://ensembl.gramene.org/Zea_mays/Info/Index), 发现重叠区间内共有5个注释基因, 其中编码过氧化物酶1前体蛋白,编码bHLH转录因子,编码S-腺苷甲硫氨酸合酶1,编码SBP结构域转录因子家族蛋白,编码类PTI1酪氨酸蛋白激酶3。而且,为已经报道的玉米核雄性不育基因[28]。分子标记定位结果显示3个恢复材料Z16、7250-14-1及A619的恢复基因均被定位于第8染色体的短臂上, 但3个恢复材料对C型不育系的恢复能力存在差别。基于以上结果我们推测, 3个自交系都含有基因, 但在不同核背景下其发挥作用的效应不同; 或者它们分别含有不同的恢复基因, 但却在第8染色体短臂上成簇存在。关于恢复基因在染色体上成簇存在的现象在其他作物上已有报道[29-30]。

本研究新鉴定出的玉米CMS-C强恢复系Z16和7250-14-1, 虽然对玉米CMS-C的CI亚组具有相同的恢复力, 但对CII和CIII亚组的恢复能力却存在差异。Z16、7250-14-1对玉米CMS-C的恢复能力也有别于自交系A619。可见玉米细胞质雄性不育系的育性恢复既受测验系的核基因影响, 也受不育系的核背景及不育细胞质类型影响。因此在将不育化制种应用于生产时, 对恢复系的选育, 既要考虑到不育系的核背景, 也要考虑所用C型不育的亚组胞质类型。

4 结论

自交系Z16、7250-14-1均能恢复不同核背景下的CI胞质, 其中对大多数核背景下的CI胞质表现为育性完全恢复, 仅对48-2背景下的CI胞质表现为育性部分恢复。Z16对C黄早四、C478的育性恢复受1对基因控制; 7250-14-1对C黄早四的育性恢复受1对基因控制, 而对C478的育性恢复则受2对基因控制, 且显现互补关系。2份自交系的恢复基因均被定位于第8染色体短臂上, 其中Z16所含恢复基因被定位于分子标记B-1至第8染色体短臂末端区域, 物理距离为494 kb; 7250-14-1所含恢复基因被定位于分子标记B-1与Chr8-86080之间, 物理距离为249 kb。

[1] Beckett J B. Classification of male-sterile cytoplasms in maize.1971, 11: 724–727.

[2] Pring D R, Conde M F, Levings C S I. DNA heterogeneity within the C group of maize male-sterile cytoplasms., 1980, 20: 159–162.

[3] Duvick D N, Snyder R J, Anderson E G. The chromosomal location of, a restorer gene for cytoplasmic pollen sterile maize., 1961, 46: 1245–1252.

[4] Snyder R J, Duvick D N. Chromosomal location of, a restorer gene for cytoplasmic male sterile corn., 1969, 9: 156–157.

[5] Wise R P, Schnable P S. Mapping complementary genes in maize: positioning theandnuclear-fertility restorer loci of Texas (T) cytoplasm relative to RFLP and visible markers., 1994, 88: 785–795.

[6] Cui X Q, Wise R P, Schnable P S. Thenuclear restore gene of male-sterile T-cytoplasm maize., 1996, 272: 1334–1336.

[7] Zhang Z F, Wang Y, Zheng Y L. AFLP and PCR-based markers linked to, a fertility restorer gene for S cytoplasmic male sterility in maize., 2006, 276: 162–169.

[8] 李鹏, 肖森林, 王淑霞, 刘娟, 赵贤容, 陈化榜. 玉米S型细胞质雄性不育恢复基因的精细定位及其候选基因预测. 山东农业科学, 2014, (8): 1–5. Li P, Xiao S L, Wang S X, Liu J, Zhao X R, Chen H B. Fine mapping of fertility restorer geneof S-type cytoplasmic male sterility and candidate gene prediction in maize., 2014, (8): 1–5 (in Chinese with English abstract).

[9] Feng Y, Zheng Q, Song H, Wang Y, Wang H, Jiang L J, Yan J B, Zheng Y L, Yue B. Multiple loci not onlyinvolved in the restoration ability of pollen fertility, anther exsertion and pollen shedding to S type cytoplasmic male sterile in maize., 2015, 128: 2341–2350.

[10] Kheyr-pour A, Gracen V E, Everett H L. Genetics of fertility restoration in the C-group of cytoplasmic male sterility in maize., 1981, 98: 379–388.

[11] 陈伟程, 罗福和, 季良越. 玉米C型胞质雄花不育的遗传及其在生产上的应用. 作物学报, 1979, 5: 21–28.Chen W C, Luo F H, Ji L Y. Some genetic aspects of the C-type cytoplasmic male-sterility in maize and its use in breeding., 1979, 5: 21–28 (in Chinese with English abstract).

[12] Vidakovic M. Genetics of fertility restoration in cytoplasmic male sterility of the C-type (cms-C) in maize., 1988, 33: 51–64.

[13] Vidakovic M, Vancetovic J. Complementary genes,andare not the unique genetic system for fertility restoration in cms-C of maize (L.)., 1997, 71: 10.

[14] Vidakovic M, Vancetovic J. The existence of a duplicated or parallel genetic system for fertility restoration in cms C (C cytoplasmic male sterility) of maize (L.)., 1997, 42: 313–316.

[15] Sisco P H. Duplications complicate genetic mapping of, a restorer gene for cms-C cytoplasmic male sterility in corn., 1991, 31: 1263–1266.

[16] 汤继华, 刘宗华, 陈伟程, 胡彦民, 季洪强, 季良越. 玉米C型胞质不育恢复主基因SSR标记. 中国农业科学, 2001, 34: 592–596. Tang J H, Liu Z H, Chen W C, Hu Y M, Ji H Q, Ji L Y. The SSR markers of the main restorer genes for CMS-C cytoplasmic male sterility in maize., 2001, 34: 592–596 (in Chinese with English abstract).

[17] Kohls S, Stamp P, Knaak C, Messmer R. QTL involved in the partial restoration of male fertility of C-type cytoplasmic male sterility in maize., 2011, 123: 327–338.

[18] Lee S L J, Earle E D, Gracen V E. The cytology of pollen abortion in s cytoplasmic male-sterile corn anthers., 1980, 67: 237–245.

[19] Colhoun C W, Steer M W. Microsporogenesis and the mechanism of cytoplasmic male sterility in maize., 1981, 48: 417–424.

[20] Tatum L A. The southern corn leaf blight epidemic., 1971, 171: 1113–1116.

[21] Weider C, Stamp P, Christov N, Hüsken A, Foueillassar X, Camp K, Munsch M. Stability of cytoplasmic male sterility in maize under different environmental conditions., 2009, 49: 77–84.

[22] Duvick D N. Cytoplasmic pollen sterility in corn.1965, 13: 1–56.

[23] Porebski S, Bailey L G, Baum B R. Modification of a CTAB DNA extraction protocol for plants containing high polysaccharide and polyphenol components., 1997, 15: 8–15.

[24] Qu J, Liu J. A genome-wide analysis of simple sequence repeats in maize and the development of polymorphism markers from next-generation sequence data., 2013, 6: 1–10.

[25] Kosambi D D. The estimation of map distances from recombination values., 1944, 12: 172–175.

[26] 赵卓凡, 黄玲, 刘永明, 张鹏, 魏桂, 曹墨菊. 玉米CMS-C同质异核不育系育性恢复的遗传研究. 遗传, 2018, 40: 402–414. Zhao Z F, Huang L, Liu Y M, Zhang P, Wei G, Cao M J. Genetics of fertility restoration in the isocytoplasm allonuclear C-group of cytoplasmic male sterility in maize.(Beijing), 2018, 40: 402–414 (in Chinese with English abstract).

[27] Ren R, Nagel B A, Kumpatla S P, Zheng P Z, Cutter G L, Greene T W, Thompson S A. Maize cytoplasmic maize sterility (CMS) C-type restorergene, molecular markers and their use. US2012090047. 2012-04-12.

[28] Nan G L, Zhai J, Arikit S, Morrow D, Fernandes J, Mai L, Nguyen N, Meyers B C, Walbot V., a master basic helix-loop-helix factor, regulates the specification and development of the tapetum in maize., 2017, 144: 163–172.

[29] Komori T, Ohta S, Murai N Y, Kuraya Y, Suzuki S, Hiei Y. Map-based cloning of a fertility restorer gene,, in rice (L.).2004, 37: 315–325.

[30] Wang Z, Zou Y, Li X, Zhang Q, Chen L, Wu H, Su D, Chen Y, Guo J, Luo D, Long Y, Zhong Y, Liu Y G. Cytoplasmic male sterility of rice with boro II cytoplasm is caused by a cytotoxic peptide and is restored by two related PPR motif genes via distinct modes of mRNA silencing., 2006, 18: 676–687.

附表1 用于Z16恢复基因定位的多态性引物

Supplementary table 1 Polymorphic markers for restoring gene mapping in Z16

引物Primer引物类型Primer type正向序列Forward sequence (5'–3')反向序列Reverse sequence (5'–3') Chr8-86080InDelCGTCGTTGAGGTGAGAAGAGCTCCGAACCTGATCCGAGTA B-2InDelACGAATACGATACGTAGCCAGTGAATCTGCGGTGAACAAA B-6-1InDelGGATGGAATATATAAAGTTTGCTGGCTCATTACCTTGGTGTCA B-1InDelGATCGTTCCGGCCCAAGAAGTAGCCGTGGAGTTGGTAGCC m-1SSRCATTGACCGGGGTAGGAAGTCATTGACCGGGGTAGGAAGT TIDP5557InDelCATGAGATCAACGGGATGCAGTAGAGATCCGGGAGGTGG Chr8-1330080InDelCCAAGTTGGATACAACGACAGAAGAAGCAACGTCTGCAGGAT IDP8573InDelCGAGTCAGTTGCTTACGGGAATTGCCGAGTGGATACAGG

附表2 用于7250-14-1恢复基因定位的多态性引物

Supplementary table 2 Polymorphic markers for restoring gene mapping in 7250-14-1

引物Primer引物类型Primer type正向序列Forward sequence (5'–3')反向序列Reverse sequence (5'–3') m-10SSRAGCGCTCGATTCCTGTAGTGGGGTGTCGTTGGTTGGGATT Chr8-86080InDelCGTCGTTGAGGTGAGAAGAGCTCCGAACCTGATCCGAGTA B-2InDelACGAATACGATACGTAGCCAGTGAATCTGCGGTGAACAAA B-6-2InDelCCAATGTTTTGATGGAAGTCCTAATTGCCATGTTCTTACCTGT B-1InDelGATCGTTCCGGCCCAAGAAGTAGCCGTGGAGTTGGTAGCC Chr8-398180InDelGCCAGTTCGGAGACAGGATACCGCCATCCAATTAACAAG IDP8319InDelTTGACCCTCCTGTTACGTGCGAGCATGGACCACATGACC IDP500InDelCACTGCCGTAGAGTAGTGCGGGCTTCAAGATCAGTCCG IDP7866InDelGGACGAAGCGATCGAGTACCAGATGAGGGAAGTGAGCAGC Chr8-1330080InDelCCAAGTTGGATACAACGACAGAAGAAGCAACGTCTGCAGGAT

Identification of fertility restoration and molecular mapping of restorer genes in two maize restore lines of CMS-C

MOU Bi-Tao1,2, ZHAO Zhuo-Fan1, YUE Ling1, LI Chuan1, ZHANG Jun3, LI Zhang-Bo3, SHEN Han3, and CAO Mo-Ju1,*

1Maize Research Institute, Sichuan Agricultural University / Key Laboratory of Maize Biology and Genetics and Breeding of Southwest China, Ministry of Agriculture, Chengdu 611130, Sichuan, China;2Edible Fungus Sericulture Research Institute, Yibin Academy of Agricultural Sciences, Yibin 644000, Sichuan, China;3Inner Mongolia Zhenjin Seed S&T Co., Ltd, Ordos 014300, Inner Mongolia, China

The objective of the present study was to identify novel and powerful restorer lines for CMS-C. So maize inbred lines Z16 and 7250-14-1 were crossed with both isonuclear alloplasmic and isoplasmic allonuclear CMS-C, CMS-T, and CMS-S male sterile lines. Self-cross and back-cross were conducted for some of the fertility restored F1for genetic analysis and restorer gene mapping. Male fertility expression was investigated for all the F1, F2and backcross populations, showing that Z16 and 7250-14-1 could restore the fertility for C Huangzaosi, C478, C698-3, and CMo17 completely, and partly restore the fertility for C48-2. Z16 could not restore the fertility for G48-2, EC48-2, ES48-2, RB48-2, and Lei48-2, while 7250-14-1 could partly restore the fertility for G48-2, EC48-2, and ES48-2, and maintain the sterility for RB48-2 and Lei48-2. Both Z16 and 7250-14-1 couldn’t restore the fertility of CMS-T, and partly restore the fertility for CMS-S. Genetic analysis showed that the fertility restoration was controlled by a pair of dominant genes for Z16 when crossed with C478 or C Huangzaosi. But for 7250-14-1, the fertility restoration was controlled by a pair of dominant genes for C Huangzaosi, and two pairs of complementary dominant genes for C478. Both of the restorer genes for Z16 and 7250-14-1 were mapped on the short arm of chromosome 8 by molecular markers. For Z16, it was mapped within a physical distance of 494 kb from the marker B-1 to the end of the chromosome, and for 7250-14-1, it was located between B-1 and Chr8-86080, with physical distance of 249 kb. This study not only provides some information for the practical application of Z16 and 7250-14-1, but also lays a foundation for the cloning and functional analysis of restorer genes.

maize; cytoplasmic male sterility; restorer gene; molecular mapping

2018-04-16;

2018-10-08;

2018-11-05.

10.3724/SP.J.1006.2019.083033

曹墨菊, E-mail: caomj@sicau.edu.cn

E-mail: m602817828@163.com

本研究由“十三五”国家重点研发计划项目(2016YFD0101206)资助。

This study was supported by the National Thirteenth Five-Year National Research and Development Program (2016YFD0101206).

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20181101.1018.006.html