黄瓜嫩果白色皮色性状的QTL初步定位

张婷婷,陈海旭，申晓青，陈书霞

(西北农林科技大学 园艺学院，陕西 杨凌 712100)

黄瓜(CucumissativusL.)是葫芦科黄瓜属植物，其果实营养丰富、口感脆嫩、风味清香，深受消费者的喜爱。黄瓜可生食，可炒食，也可腌渍，因此黄瓜商品果实的外观品质如果皮颜色、刺瘤有无及果实的长度、粗度等重要商品性状，对销售影响很大[1]。其中黄瓜嫩果皮色是影响消费最主要的直接因素，尤其随着市场向多元化和专用化的转变及人们对蔬果品质越来越高的需求，这种重要外观品质的影响就愈发明显。一般而言，市场上主栽的黄瓜品种以绿皮品种为主，白色果皮的品种较少。因此，研究黄瓜嫩果白色果皮这一重要性状的遗传规律、QTL定位及候选基因预测，可为满足市场需求的黄瓜新种质创制奠定物质和技术基础，具有重要的现实意义。

目前发现的与黄瓜果实性状相关的基因有20多个[2]，其中控制黄瓜皮色的基因主要包括4个：2个yg基因(控制黄绿果皮)、1个Dg基因(控制深绿果皮)和1个w基因(控制白皮)[3-6]。虽然前人在对黄瓜皮色的研究中多将其作为质量性状，但在育种实践中，黄瓜皮色遗传经常表现出连续变异的特点，许多中间过渡色在分离后代中表现出来。目前对黄瓜嫩果皮色作为数量性状进行研究的相关报道甚少且结果不尽相同。Wenzel等[7]利用Gy14和P1432860为亲本构建了3个遗传群体(F3、BC1P1和BC1P2)，用于对黄瓜皮色性状进行QTL定位，最后定位到4个QTL位点，分别位于DE、B、A和F 4个连锁群上。苗晗等[3]利用由9110Gt和9930构建的一个148份的重组自交系群体，对黄瓜皮色均一度进行QTL定位，结果显示检测到1个QTL位点，位于染色体5上，并与果皮表面光滑性状、老瓜表皮网纹等性状紧密关联。虽已有学者将嫩果皮色作为数量性状对茄子和黄瓜进行了遗传分析，并得到了相应的结果[8-9]，但关于其QTL定位的研究还较少见，因此亟待开展该性状的QTL定位及精细定位，并进行候选基因的预测。

此前本课题组对2个黄瓜组合的亲本及其F1、F2和回交群体的嫩果皮色进行了测定[10]，所获F2代的皮色次数分布图更加符合盖钧镒[11]提出的“质量-数量性状”的特点，即皮色的次数分布不同于典型数量性状的正态分布，也不同于质量性状的独立分布，而是表现出类似于质量性状的次数分布可以分组的趋势，但组界模糊。为了更准确地了解和认识黄瓜嫩果皮色的遗传规律，有必要利用主基因+多基因混合遗传模型进行分析。农艺性状的遗传规律及基因克隆或定位，难点在于性状的准确测定，果实皮色也是如此。在部分研究中，对果色多采用目测进行分类，忽略了一些中间过渡色。近年来对园艺作物果色的研究表明，果色大多属于数量性状，并且有的作物会随杂交果色的不同表现出不同的显隐性。本研究以嫩果皮色不同的黄瓜种质Q8、Q16、Q24为亲本材料，分别配制Q16×Q8和Q16×Q24杂交组合及6世代遗传群体，对控制黄瓜嫩果皮色的QTL进行初步定位，以期为黄瓜嫩果皮色的育种设计奠定分子理论基础和提供目标基因。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试黄瓜亲本材料由西北农林科技大学园艺学院黄瓜课题组提供。以经高代自交的嫩果皮色为深绿色的Q16为母本(P1)，分别以高代自交纯合的嫩果皮色为黄白色的Q8(P2-1)和Q24(P2-2)为父本，进行Q16×Q8(组合Ⅰ)和Q16×Q24(组合Ⅱ)杂交组合的配制。利用亲本杂交构建F1代，F1自交得F2代，F1与亲本母本杂交得回交一代B1，与亲本父本杂交得回交一代B2。2011年10月下旬分别收获亲本及杂交组合F1代种子，在其生长期初步考察P1、P2和F1的嫩果皮色性状。2012年2月，分别种植2个组合的亲本及其F1代材料， 进行自交。2012年6月，收获各个世代材料的种子。2012年7月10日，采用直播的方式，分别播种2个组合的6世代群体材料(P1、P2、F1、F2、B1和B2)。各世代种植株数群体大小为50，50，50，280，150和150株。当幼苗长到3～4片真叶时间苗、移栽，畦宽80 cm，株距25 cm，其他田间管理措施同常规苗。

1.2 方 法

1.2.1 嫩果皮色的测定 嫩果皮色首先采用目测法测定。目测时参照黄瓜种质资源描述规范和数据标准[12]，结合供试材料亲本及F2代群体果实颜色分离情况，将黄瓜嫩果皮色分为黄白、绿白、浅绿、绿和深绿5个级别(图1)。

图1 黄瓜果色分类的标准颜色Fig.1 The standard colors of classification in cucumber fruit

为了减小目测法的误差，同时利用CR-400色差仪进行嫩果皮色的测量。每单株随机选取3个开花12～15 d的嫩瓜，取每个果实果皮颜色均一、能代表该单株果皮颜色的中段部分，于每日上午10:00-11:00选择 5个点(点与点间距3 cm)进行测定，取5个点的平均值作为此果实的最终测量值，每单株取3个果实的最终测量值记为该单株的嫩果皮色值。该值包含L(表示亮度值，代表表皮光滑度)、a*(表示红绿色值，负值偏绿，正值偏红)和b*(表示黄蓝值，负值偏蓝，正值偏黄)3个数值。

将黄瓜嫩果皮色为黄白、绿白、浅绿、绿和深绿5种颜色分别确定为1，2，3，4，5级，采用色差仪测定的这5个级别的L、a*和b*的取值范围见表1。根据确定的L、a*和b*的取值范围，对各分离世代的黄瓜嫩果皮色进行准确分级。

表1 黄瓜嫩果果色分级标准Table 1 The class stable of immature cucumber fruit color

注：L.亮度值；a*.红绿色值；b*.黄蓝色值

Note:L.Lightness coordinate;a*.Red(+)/green(-) color attribute;b*.Yellow(+)/blue(-) color attribute

1.2.2 SSR引物的筛选 对黄瓜分离群体按单株取样，采用CTAB法提取黄瓜嫩叶DNA[13]，使用BioPhotometer核酸测定仪(由Eppendorf公司生产)测定DNA质量浓度，根据所测的DNA质量浓度，将其稀释至60 ng/μL，贮存于-20 ℃备用。

试验所用SSR引物来自根据黄瓜基因组连锁遗传图谱开发出的995对备选的SSR引物[14]。PCR反应体系为：60 ng/μL模板DNA 2 μL，10 ng/μL引物(上游+下游)2 μL，PCR Buffer 1.5 μL，MgCl20.9 μL，10 mmol/L dNTP 1.2 μL，ddH2O 7.8 μL，2.5 U/μLTaq酶 0.1 μL。PCR反应程序为：94 ℃预扩增5 min；94 ℃ 45 s，51 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35个循环；最后72℃ 延伸10 min；4 ℃保存。PCR产物经变性聚丙烯酰氨凝胶电泳后银染显色，统计带型，筛选出与双亲带型不一致的多态性引物。

1.2.3 遗传图谱的构建与QTL位点分析 将筛选出的多态性引物用于F2群体的检测，对检测结果的带型进行统计，带型与母本一致记为2，与父本一致记为0，与F1一致记为1，缺失记为-1。利用IciMapping Version 3.2软件构建遗传图谱，以所构建的图谱为给定染色体，结合F2的嫩果皮色表型结果，在最大遗传距离为50.0 cM、LOD值为3.0的条件下，在全基因组内对黄瓜嫩果果皮为白色的数量性状进行QTL定位分析及遗传参数确定。

2 结果与分析

2.1 黄瓜嫩果皮色多态性SSR标记的筛选

采用995对SSR引物对供试黄瓜亲本Q16、Q8、Q24的嫩果皮色进行多态性筛选，其中121对多态性引物在组合Q16×Q8中扩增出了清晰可辨的带型，多态引物的比率为12.2%。对产生多态性的引物进行F1验证，结果有79对符合要求。有126对多态性引物在Q16×Q24组合中扩增出了清晰可辨的带型，多态引物的比率为12.7%。同样对多态性引物进行F1验证，结果显示有80对引物符合要求。

2.2 黄瓜嫩果皮色遗传连锁图谱的构建

利用IciMapping Version 3.2软件对黄瓜F2分离群体SSR标记进行连锁图谱构建，在组合Q16×Q8的遗传图谱(图2)中，包含了7个连锁群，74个SSR标记，该遗传图谱的覆盖范围为2 400.73 cM，平均距离为32.4 cM；在组合Q16×Q24构建出的遗传图谱(图3)中包含了7个连锁群，76个SSR标记，遗传图谱的覆盖范围为1 623.37 cM，平均距离为21.36 cM。

在组合Q16×Q24中，80个标记中有76个标记被分成7个连锁群，另外4个标记不与任何标记连锁，表明这4个标记代表了黄瓜基因组的4个独立座位。在组合Q16×Q8中，79个标记中有74个标记被分成7个连锁群，另外5个标记不与任何标记连锁，这可能是黄瓜基因组的5个独立座位，也可能是由于遗传连锁图的标记不多而造成的连锁失败。对于该情况有待于进一步验证。

图2 黄瓜品种Q16×Q8组合的遗传图谱Fig.2 The genetic map of the cross Q16×Q8 in cucumber

2.3 黄瓜嫩果白色皮色的QTL定位

使用QTL IciMapping Version 3.2软件的复合区间作图法，对控制黄瓜嫩果白色皮色的QTL进行扫描，扫描在LOD临界值为3.0下进行。由图4可以看出，组合Q16×Q8获得与此性状相关的2个QTL，分别位于第1和第3染色体上；由表2可知，第1染色体上的位点位于标记SSR04079与SSR03886之间，LOD值为3.367，加性效应为-0.261，显性效应为-0.666，可解释的表型变异为9.276%；第3染色体上的位点位于标记SSR10370与标记SSR06791之间，LOD值为18.302，加性效应为0.966，显性效应为0.836，可解释的表型变异为50.622%。

图5显示，组合Q16×Q24获得关于黄瓜嫩果白色皮色的1个QTL位点，该位点位于第3染色体上，处于标记SSR10370与标记SSR05572之间，LOD值为12.221，加性效应为1.158，显性效应为0.796，可解释的表型变异为68.976%(表2)。

图3 黄瓜品种Q16×Q24组合的遗传图谱Fig.3 The genetic map of the cross Q16×Q24 in cucumber

图4 黄瓜品种Q16×Q8组合嫩果白色皮色的QTL定位Fig.4 The QTL mapping of the fruit white color in cross Q16×Q8 of cucumber

组合 Cross连锁群Linking group位置Position标记区间Marker interval置信区间Confidence intervalLOD值LOD贡献率/%Genetic contribution rate加性效应Additive effect显性效应Dominant effectQ16×Q8LG110304079-0388622.793.3679.276-0.261-0.666LG316410370-067911.2718.30250.6220.9660.836Q16×Q24LG339010370-0557222.5312.22168.9761.1580.796

图5 黄瓜品种Q16×Q24组合嫩果白色皮色的QTL定位Fig.5 The QTL mapping of the fruit white color in cross Q16×Q24 of cucumber

3 讨 论

3.1 黄瓜嫩果皮色的测定方法与分级

20世纪50年代以前，大多数研究由于试验条件的限制，简单地根据目测结果将黄瓜嫩果皮色划分为质量性状。即使是近年来，也有一些研究根据目测结果将黄瓜嫩果皮色进行简单划分，但目测的色域较广，因此，这些研究结果所得的结论往往忽略了多基因作用的效应[10]。果实色素含量测定需要对果实削皮，这样就很容易附带部分果肉，因此果肉中的色素就容易给果皮颜色的测定值带来误差;另外，色素含量测定相对较为繁琐，且测定有多种色素，没有哪种色素可以完全用来代表果皮颜色，鉴于上述原因，目前色差仪在多种园艺作物果实皮色的测定中有了较广泛的应用[15-16]。王建科等[17]基于黄瓜品种Q1(深绿色)×H4(乳白色)组合，根据对果皮皮色的目测结果及色差仪测定的L和C值，将分离群体后代果皮颜色分为7个等级。本试验对供试黄瓜亲本及其组合各后代个体的嫩果皮色进行测定后，结合目测结果分别对L值、a*值、b*值进行了分级，将其划分为5个等级，结果显示该分级方法能较好地与亲本及后代个体中的目测结果相吻合。

3.2 黄瓜的遗传图谱

世界上第1张黄瓜遗传图谱是由Fanourakis等[18]于1987年构建的，该遗传图谱包含4个连锁群，13个标记，覆盖168 cM遗传距离。目前,科研人员认为最饱和且准确的一张黄瓜遗传图谱是2009 年Ren等[14]构建的，该研究以 GY14×PI183967 杂交获得的重组自交系为作图群体，利用从黄瓜全基因组测序开发的大量 SSR 引物为作图标记，构建了一张包含7个连锁群、995个SSR标记的遗传图谱，覆盖 572.9 cM，标记平均间距为 0.6 cM 。目前针对黄瓜所构建的遗传图谱较多，构图采用的分子标记类型、作图群体、标记密度等均不相同[19-23]。

本试验利用黄瓜F2遗传群体构建出的遗传图谱有7个连锁群，组合Q16×Q8覆盖的基因组长度为 2 400.73 cM，组合Q16×Q24覆盖的基因组长度为1 623.37 cM，较理想图谱的覆盖范围800～1 000 cM大。本试验SSR标记的多态性较小，导致遗传图谱饱和度较低，今后可通过增加标记数量和群体数量来提高遗传图谱的饱和度；另外，构建的图谱大小不仅与基因组大小相关，还与试验材料同所用群体的类别有关。试验亲本间遗传差异的大小密切影响着遗传图谱的大小。另外，图谱覆盖范围大，也可能是由于偏分离现象造成的。本试验中发生偏分离的标记为28个。导致偏分离现象产生的原因有很多，如：(1)减数分裂时期染色体易位、倒位等原因造成联会困难；(2)配子或合子的选择性；(3)连锁相邻位点之间的互作；(4)环境因素等。另外，非同源重组、基因转换、转座因子和作图群体亲本某些位点的杂合等，都是可能的原因[24]。克服偏分离影响的最简单方法就是作图时将偏分离标记剔除掉，本试验中尝试将χ2大于20的偏分离标记剔除掉后，组合Q16×Q8组合的覆盖范围由原来的2 400.73 cM降到1 651.78 cM；另外，这也与软件有一定联系，同样的条件下，在JoinMap 4.0的处理下，组合Q16×Q24的覆盖范围由原来的1 623.37 cM降到1 171 cM，此现象可证实本试验存在较严重的偏分离现象。鉴于将偏分离标记剔除掉会降低基因组的覆盖率和漏掉某些QTL，加之本试验标记数量较少，因此没有大量剔除偏分离标记。

3.3 黄瓜嫩果皮色的QTL定位

本试验通过F2对2个组合的黄瓜嫩果白色皮色性状相关基因进行扫描定位，组合Q16×Q8有2个QTL位点，分别位于第1和第3染色体，这与遗传规律中的由2对主基因控制黄瓜嫩果皮色相一致，也与孙小镭等[9]的研究结果一致；而组合Q16×Q24有1个QTL位点，位于第3染色体上。本研究2个组合在第3染色体上的位点拥有共同的标记SSR10370，均对白色表型变异具有较高的贡献率，二者达到了相互印证。此外，董绪[25]对黄瓜H4×Q1杂交群体的嫩果皮色白色基因进行定位，将其初步定位于染色体3上。王建科等[17]认为，黄瓜嫩果果色相关QTL位点与第3连锁群具有密切关系。这些结论进一步证实了本研究中定位的QTL的准确性。而本研究中组合Q16×Q24未扫描到第1染色体上的QTL位点，这是由很多原因造成的。影响QTL 定位效果的因素很多,包括群体类型、规模、涉及的QTL 数目、遗传标记的密度、性状遗传力等。在本研究中，Q16×Q24群体所构建的遗传群体与Q8×Q24构建的遗传群体有1个不同的亲本，因此定位结果不一定一致。另外，Q16×Q24群体所构建的遗传图谱中位于染色体1上的标记数量较另一组合少，这也可能导致1个微效QTL未被检测到。还有可能是2个组合由于亲本不一致，其QTL的遗传力不同，在Q16×Q24组合中群体数量过少导致位于染色体1上的QTL未能成功检测到。

此外，本研究的主效QTL与已研究的控制白色果皮的w基因在染色体3上存在位置相近的情况，但本试验研究的是数量性状基因座，因此在此地存在1个主效QTL，并不一定只包含了1个控制果皮色的w基因。申小青等[10]分别以2个杂交组合Q16(深绿色)×Q8(黄白色)及Q16 (深绿色)×Q24(黄白色)构建6个世代遗传群体，通过目测与色差仪测定相结合的方法，对6个世代各单株的黄瓜嫩果皮色性状进行观察和分级处理，结果认为2对组合中，黄瓜嫩果皮色性状均由 2对主基因+多基因控制。因此有理由认为，黄瓜的嫩果皮色除了由1对主基因控制外，可能还有多个微效多基因控制。在育种实践中可以明显观察到，黄瓜嫩果皮色的遗传常常表现出同时受到1对或多对主基因和效应较小的数量性状基因控制的特点，即莫惠栋[26]提出的“质量-数量性状”概念。盖钧镒[11]又对该定义作了进一步阐释，即质量-数量性状是指一类既受主基因控制，同时又受 QTLs控制的性状。同时在实际的育种工作中可以观察到，黄瓜中与嫩果皮色有关的分离后代呈现出许多中间型的过渡色，类似数量性状的连续变异，不是简单的质量性状。因此，单纯将黄瓜嫩果皮色作为质量性状进行研究，不能准确描述其遗传规律，这一点与王建科等[17]的观点一致。

4 结 论

本试验利用分子标记的方法构建了2张黄瓜遗传图谱，另外将目测法与色差仪法结合，将黄瓜皮色性状视为数量性状划定皮色等级标准。结合所构建的2张遗传图谱分别对2个黄瓜杂交组合的嫩果白色皮色进行QTL定位，结果表明，在Q16×Q8组合的7个连锁群上共定位到2个QTL位点，分别位于第1与第3染色体上；在Q16×Q24组合的7个连锁群上共定位了1个QTL位点，位于第3染色体上。