金银花提取物对肉牛瘤胃体外发酵、挥发性脂肪酸组成及气体产生的影响

黄祥元，唐 伟，龙冰雁

反刍动物消化过程产生氢气、甲烷和二氧化碳，这些气体是全球变暖的主要因素。甲烷是一种温室气体，其导致全球变暖的潜力是二氧化碳的21倍。瘤胃中产生甲烷的能量损失相当于动物饲料总能量的6%～10%（易礼胜等，2002）。所有人为产生的甲烷中大约30%是由肠道排放的，主要来自瘤胃中饲料的发酵。FAO预计，到2050年全球肉类和牛奶产量将翻一番，而这些产量的增加也将对环境产生负面影响。许多化学添加剂具有减少瘤胃甲烷排放的潜力，但这些添加剂要么对有益的瘤胃微生物产生副作用，要么对宿主动物产生毒性。因此，急需寻求安全的方法来改变瘤胃发酵特性。植物提取物包括次生代谢物，已在传统医学和食品防腐剂中使用了几个世纪，植物提取物可作为瘤胃发酵的调控剂来减少甲烷生成（Kim等，2012）。金银花是一种传统的药用植物，在韩国、日本和中国很常见。严雪龙等（2016）报道，金银花提取物具有其他生物和药物特性，包括抗炎、抗菌、抗病毒，同时也显示出肝脏保护功能。Park等（2014）研究表明，金银花甲醇提取物中黄酮类化合物含量约为71.023 g，主要成分为表没食子儿茶素。表没食子儿茶素是一种黄烷3醇化合物，包括儿茶素、天然酚、抗氧化剂和浓缩单宁。浓缩单宁与蛋白质紧密结合，根据其来源和使用的浓度显示出有害和有益的影响，饲用豆科植物的浓缩单宁可通过抑制产甲烷菌来降低瘤胃甲烷的排放。因此，本研究通过体外试验评估金银花提取物对瘤胃发酵、挥发性脂肪酸组成及气体产生的影响。

1 材料与方法

1.1 瘤胃接种与体外培养 以体重为450 kg的肉牛作为瘤胃液供体。苜蓿草和浓缩料按照60∶40的比例加工成全混合日粮，每天分别在早上9点和下午5点对肉牛各饲喂1次，饲喂量为体重的2%。每天早上饲喂前给肉牛提供水、矿物质和维生素，并收集其瘤胃液。瘤胃液经4层纱布过滤后与缓冲液混合，并在39℃下保存。将15 mL的瘤胃液缓冲混合物（2∶1）分配到50 mL的血清瓶中，其中含有0.3 g苜蓿草底物和金银花提取物（0%、3%、5%、7%和9%）。将血清瓶灌满无氧氮气，盖上橡胶塞，置于摇瓶（120r/min）中39℃孵育48 h。体外试验采用45个血清瓶（5个处理×3次孵育×3次重复）。

1.2 瘤胃体外发酵特性及其他产生 参考Theodorou等（1994）的研究方法测定气体产量。采用改进的尼龙袋消解法测定离体干物质降解率。在孵育后，一个带有基质的尼龙袋在水浴中用以100 r/min洗2次，每次30 min。然后将洗过的尼龙袋60℃烘干至恒重。用血清瓶的重量差来计算干物质降解率。挥发性脂肪酸含量采用高效液相色谱法进行测定，使用添加碱-次氯酸盐混合培养的苯酚显色剂对氨氮进行分析。

1.3 微生物丰度分析 微生物PCR引物设计及定量方法参考Denman等（2007）研究方法。

1.4 统计分析 使用SAS统计分析系统软件，采用常规线性模型程序进行数据分析。通过与对照对照比较，确定金银花添加水平对培养物pH、干物质降解率、氨氮、挥发性脂肪酸、气体生成和微生物丰度的影响，并Duncan"s 进行多重比较，确定差异显著性。用正交多项式对比处理确定线性和二次效应，以评估不同金银花添加水平的线性和二次曲线效应。所有分析均以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 瘤胃发酵特性 由表1可知，pH值与金银花添加水平呈正相关。在12 h时，金银花提取物组较对照组显著提高了瘤胃氨氮浓度（P＜0.05）。整体来看，5%金银花提取物组似乎更有价值。

2.2 瘤胃挥发性脂肪酸 由表2可知，在24 h时，随着金银花提取物水平的升高，瘤胃总脂肪酸浓度显著降低（P＜0.05），但乙酸浓度随金银花提取物水平的升高表现为显著升高（P＜0.05），但丙酸浓度随着金银花提取物水平的升高在12 h时表现为显著降低（P＜0.05），乙酸与丙酸比例表现为显著线性升高（P＜0.05）。

2.3 瘤胃发酵气体产生 由表3可知，随着金银花浓度的升高，气体总量在瘤胃体外发酵24 h后有升高趋势（P=0.05），同时，金银花提取物水平在3%时也有显著提高瘤胃体外发酵24 h后气体总量的趋势（P=0.06）。随着金银花提取物水平的升高，甲烷生成量表现为显著线性降低（P=0.01）。

2.4 瘤胃微生物含量 由图1可知，对照组微生物表达量均高于其他各组，其中金银花提取物添加水平为3%时较对照组显著降低了白色瘤胃球菌的相对表达量（P＜0.05），但对照组与9%金银花提取物组对白色瘤胃球菌相对表达量的影响差异显著（P＞0.05）。金银花提取物组产琥铂酸丝状杆菌相对表达量较对照组降低了30%多（P＜0.05），而3%金银花提取物水平组黄化瘤胃球菌组降低了29%（P＜0.05）。0、3%、5%、7%和9%金银花提取物组产甲烷菌分别降低45%、26%、44%和29%。

3 讨论

瘤胃氨氮浓度是日粮氮向微生物氮转化效率的粗略预测因子，微生物氮是瘤胃细菌合成的主要氮源。单宁可以降低瘤胃中蛋白质降解和脱氨的速度，降低瘤胃氨氮浓度。氨氮浓度的降低可能是由于部分氨基酸的脱氨基作用减少，或可用性下降造成的氨基酸蛋白质降解，这可能是由于浓缩单宁蛋白复合物的形成，选择性抑制微生物或酶参与分解代谢的蛋白质。本研究结果发现，孵育24 h后，干物质降解率随金银花浓度的增加呈线性下降，这与Tan等（2011）的研究结果一致。

表1 金银花提取物对瘤胃发酵特性的影响

表2 金银花提取物对瘤胃挥发性脂肪酸含量的影响

表3 金银花提取物对瘤胃发酵气体产生的影响

图1 金银花提取物对瘤胃体外发酵12h后细菌表达量的影响

Paengkoum等（2015）发现，添加来自山竹果果皮中的浓缩单宁可以降低乙酸和丙酸的浓度，并增加乙酸与丙酸的值，且随着浓缩单宁浓度的增加，挥发性脂肪酸总浓度呈线性下降，同时也降低瘤胃发酵速率。本研究结果显示，添加金银花提取物在24 h内显著降低干物质降解率，这反映了其对微生物活性的负面影响。Paengkoum等（2015）研究表明，来自山竹果皮的浓缩单宁降低了气体总量的产生，并导致气体产量随浓缩单宁浓度的增加线性下降。孵育48 h时，随着金银花浓度的增加，二氧化碳呈线性下降，作者推测金银花提取物中的单宁抗产甲烷活性取决于单宁类型和剂量。

浓缩单宁可以抑制瘤胃中主要的纤维分解菌，其抑制程度取决于单宁类型和剂量。但本试验结果显示了不同的结果，产甲烷古菌在3%、5%、7%和9%的金银花提取物组分别减少45%、26%、44%和29%。与其他浓度相比，3%金银花提取物降低了纤毛虫数量。金银花是药用植物，具有抗菌特性，可能通过消化大量瘤胃细菌而降低微生物蛋白合成。Kim等（2012）用金银花提取物与瘤胃液孵育的体外试验和定量PCR分析发现，培养物中纤毛虫相关的产甲烷菌数量比对照组显著降低，而纤维分解菌数量增加。其认金银花提取物含有皂苷、有毒生物碱和单宁等化合物，对细菌有毒害作用。

4 结论

金银花提取物可以影响体外瘤胃发酵，金银花提取物可作为一种瘤胃发酵调节剂来抑制甲烷的产生，同时对瘤胃营养物质的消化产生最小的影响。同时它也可以通过抑制产甲烷菌的生长、发育和活性，或通过减少与产甲烷菌相关的原生动物的数量来降低甲烷产生。本试验结果发现，5%金银花提取物添加水平显著降低甲烷排放。