小鼠局部淋巴结实验(BrdU-ELISA)在25%氰氟草酯乳油皮肤致敏性检测中的应用

秦 珩，程 洁，靳苏香，钱 雯，章 婉，严 婷，董 昊，张成香，张璐璐，王玉邦, ，环 飞*

(1. 江苏省医药农药兽药安全性评价与研究中心，南京 211166；2. 南京医科大学公共卫生学院，南京 211166)

反复接触农药可能导致皮肤致敏反应，皮肤出现红斑、水肿、丘疹、焦痂、瘙痒等体征的变态反应性接触性皮炎(allergic contact dermatitis, ACD)。ACD是有关农药生产、使用者的健康与职业卫生重要问题。目前评估农药皮肤致敏性的方法是豚鼠实验，主要包括豚鼠局部封闭涂皮实验(Buehler test, BT法)和豚鼠最大值实验(guinea pig maximisation test, GPMT)，但动物使用数量多，时间长达30天，结果受主观影响，近年来发展小鼠局部淋巴结分析实验(local lymph node assay，LLNA)，LLNA方法的实现了小动物替代大动物，动物使用量减少，结果更加客观，已被国家标准采纳为标准实验方法[1]。但该方法需要使用3H或125I放射性同位素、特殊仪器以及同位素实验室等条件，还可能污染环境和实验人员暴露风险，推广作为农药致敏性常规检测相对困难。通过BrdU标记示踪和酶联疫吸附(ELISA)法测定细胞增殖已被广泛应用各种实验[2-4]，本次实验方法采用ELISA检测技术，提高实验的灵敏性，同时避免放射性同位素掺入法的放射性污染，推广在农药致敏性评价中应用灵敏、短期且无污染的安全性评价方法。

1 材料和方法

1.1 实验动物

清洁级、9周龄(初始体重19.8～24.8 g)、30只雌性BALB/c小鼠[5]，由扬州大学比较医学中心提供[SCXK (苏) 2017-0007]，合格证编号：201712819。动物饲养于南京医科大学卫生分析检测中心动物屏障设施中[SYXK (苏) 2015-0009]，实验动物使用符合实验动物伦理委员会审查的要求。动物实验符合3R原则。

1.2 主要试剂与仪器

AOO(丙酮∶橄榄油=4∶1，上海凌峰化学试剂有限公司、益海嘉里食品营销有限公司)、超纯水(美国Millipo公司密理博纯水仪自制)、BrdU(Sigma公司)、BrdU-ELISA试剂盒(Abcam公司)、pH 7.0无钙镁磷酸盐缓冲液(PBS，HyClone)。电子天平(T1000型、常熟市双杰测试仪器厂)，酶标仪(SpectraMax/M2e、美谷分子仪器(上海)有限公司)，CO2培养箱(Heracell-150、德国贺利氏公司)，超净工作台(SW-CJ-2FD、苏州净化设备有限公司)，倒置显微镜(CK41、日本Olympus公司)，离心机(DD-5M、上海卢湘仪离心机仪器有限司)，游标卡尺(0 ～ 150 mm、上海美耐特实业有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 分组与染毒

将30只BALB/c小鼠，随机分为6组，每组5只。氰氟草酯乳油设3个(100%、50%、25%)浓度组，受试样品采用橄榄油稀释，采用同时设阴性对照组(橄榄油)、设阴性对照组(AOO)及阳性对照组(25%已基肉桂醛，采用AOO溶解)。小鼠耳背涂抹25 μL受试物，每天1次给样，连续3 d，第6天给小鼠腹腔注射BrdU(溶剂PBS，5 mg/只)，24 h后处死小鼠。

1.3.2 耳厚测定

记录实验开始和结束时的耳厚度。

1.3.3 耳重测定

实验结束采用打孔器取下直径8 mm耳片，称重。

1.3.4 淋巴结重量与细胞悬液的制备

取双侧耳后淋巴结并称重；200目筛网研磨制备单细胞悬液，将细胞转移到15 mLPBS。

1.3.5 Brdu-ELISA测定

将100 μL细胞悬液加入到平底96孔板，每只动物3个平行孔。1200 r/min离心10 min，弃上清后烘干培养板，每孔加入固定液200 μL，室温固定30 min后离心弃固定液，加入anti-BrdU抗体溶液100 μL，室温孵育1 h后离心弃抗体溶液，加入洗涤液200 μL清洗抗体溶液，离心弃洗涤液，清洗3次，加入TMB底物溶液100 μL，常温、避光孵育15 min，酶标仪波长450 nm，测量吸光度。

1.4 统计学方法

计算刺激指数(SI)：SI1为实验组淋巴结重量平均值与对照组淋巴结重量平均值的比值；SI2为实验组发(吸)光值平均值与对照组发(吸)光值平均值的比值。采用统计软件SPSS 22.0计算均数与标准差，小鼠体重采用多组间比较用单因素方差分析，组间比较及多组与对照组比较用Dunnett-t检验，检验水准α=0.05，P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 体重

结果显示各剂量组各观察点的小鼠体重与对照组比较，差异均无显著性(P> 0.05)(未列图表)。

2.2 耳厚度和耳重

结果显示，各剂量组的耳染毒区未观察到明显红斑、水肿，耳厚度增加和耳重均不超过对照组的25%。

2.3 淋巴结重量

由表1结果显示，实验组、阴性对照组和阳性对照组的淋巴结重量变化情况，溶剂和空白对照组的刺激指数SI1<1.6，阳性对照组(25%肉桂醛)的刺激指数SI1>1.6，实验系统可靠；25%氰氟草酯乳油低、中、高剂量组的刺激指数SI1<1.6，无剂量反应关系。

2.4 BrdU含量测定

由表1结果可见，实验组、阴性对照组和阳性对照组的BrdU含量变化情况，溶剂和空白对照组的刺激指数SI2<1.6，阳性对照组(25%肉桂醛)的刺激指数SI2>1.6，实验系统可靠；25%氰氟草酯乳油低、中、高剂量组的刺激指数SI2<1.6，无剂量反应关系。

3 讨论

2009年刘珍等[6]对实验方法改进，增加刺激指标如耳厚和耳重的检测，2010年OECD增加了LLNA：BrdU-ELISA(TG442B)通过ELISA方法测定淋巴细胞增殖情况替代放射性同素的检测[7]。2013年阳晓燕等增加了刺激指标(耳厚差、耳重)，致敏性指标(淋巴结重量，淋巴细胞计数，ATP与荧光素反应后的发光强度)[8]。本次实验我们也相应增加刺激指标与致敏性指标，有利于更好判断是农药直接作用造成的刺激反应，还是变态反应。并通过定量测定小鼠引流淋巴结细胞的BrdU掺入量，分析小鼠耳部皮肤局部涂抹农药后，相应耳后引流淋巴结的淋巴细胞的增殖情况判定农药致敏性。本方法的25%氰氟草酯乳油致敏性结果SI1和SI2均小于1.6，结果为阴性，与本实验室的采用传统方法检测的结果一致。

小鼠局部淋巴结(BrdU掺入法)实验是用小鼠替代豚鼠的实验方法，每组最少可以使用4只小鼠，明显减少了实验动物数量；并以体积小的动物代替体积大的动物；并且实验周期仅7 d时间，大量节约动物设施的使用面积、时间、耗能；改进了实验结果的测量方法，酶标仪定量检测使结果更加客观科学，避免传统实验肉眼观察皮肤反应评分带来的主观性，实现了3R原则(减少、优化与替代)[9]。2010 年替代方法验证多机构协调委员会(ICCVAM)采纳LLNA：BrdU-ELISA作为皮肤致敏性的替代方法[10]。冼静雯[11]等采用BALB/c小鼠 LLNA:BrdU-ELISA对多种化学物研究表明，该法阳性预测率为 90%、阴性预测率为 100%、假阳性率为 17%、假阴性率为 0、灵敏度为 100%、特异度为 83%、准确度为 93%。因此，高灵敏度，省时，省力，费用低的LLNA：BrdU ELISA有必要在我国农药致敏性常规检测领域推广。

表1 淋巴结重量与BrdU的测定结果Table 1 Determination of lymph node weight and BrdU staining