实验动物遗传质量控制微卫星标记检测法重复性研究

王 洪，戴方伟，王 静，魏 杰，杜江涛，黄树武，贾松华，岳秉飞*

(1. 中国食品药品检定研究院，北京 102629；2. 浙江省医学科学院，杭州 310013；3. 广东省实验动物监测所，广州 510663)

微卫星(microsatellites)，也叫做短串联重复(short tandem repeat，STR)。该序列由2～6 bp的核心序列和相对保守的侧翼序列组成。根据侧翼序列设计引物，扩增结果能够反映出不同品系或不同个体的实验动物的核心序列重复个数的差异。对不同品系或不同群体在微卫星核心序列上的差异进行统计分析，获取实验动物的遗传背景信息。参照实验动物国家标准GB 14923-2010[1]，“可选用DNA多态性检测法进行群体遗传质量检测”。我们国家的实验动物遗传质量检测标准GB/T 14927.1-2008[2]仍采用生化标记检测法，而美国Jackson实验室和Charles River实验室均采用微卫星标记以及SNP标记等分子生物学方法[3-4]。

实验动物的遗传质量控制是所有其他质量控制的基础，只有在遗传质量满足标准要求的前提下，其他方面的质量控制才有意义。为了满足送检单位的需求，提升检测能力，满足国际合作与交流的需要，急需建立微卫星标记方法的检测标准，为实验动物遗传质量控制提供检测依据。本研究针对团体标准[5]中微卫星标记检测法，在3家实验室进行方法验证，证实该方法能否用于实验动物遗传质量检测，在不同的实验室是否具有较好的重复性[6]。

1 材料和方法

1.1 实验动物

6只C57BL/6J实验小鼠，SPF级，8周龄，雌雄各半，体重20～22 g，来源于国家啮齿类实验动物种子中心[SCXK (京) 2014-0013]。小鼠取材于中国食品药品检定研究院动物实验设施[SYXK (京) 2016-0004]，并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。

1.2 主要试剂与仪器

Tris饱和酚，氯仿，异戊醇，采购于国药集团化学试剂有限公司；Takara HS Taq 酶(R007B)，100 bp DNA ladder(3422A)，DL500 DNA marker购自TaKaRa(A701A和A801C)，琼脂糖(5260)和6× loading buffer(A6101)均购自北京六合通经贸有限公司。所用PCR仪为美国ABI VeritiTM96；微量分光光度计为美国Thermo Nanodrop 2000；凝胶成像系统为美国Kodak GL212Pro；基因测序仪ABI3730xl。

1.3 实验方法

1.3.1 微卫星位点选取

本研究随机选取团体标准[5]中12个微卫星位点，所用引物信息见表1。

1.3.2 模板DNA提取[7]

实验小鼠尾尖组织样本5 mm，用酚/氯仿抽提法提取基因组DNA。经微量分光光度计检测，将所有DNA浓度均稀释为50 ng/μL。

1.3.3 PCR体系和反应条件[7]

PCR反应体系为20 μL，其中含10× PCR buffer：2 μL，上下游引物(10 pmol/μL)：各1 μL，dNTP(100 μmol/L)：1.2 μL，Taq酶(5 U/μL)：1 μL，50 ng/μL基因组DNA：1 μL，镁离子终浓度1.5 mmol/L，无菌蒸馏水补齐20 μL。反应条件为94℃预变性, 5 min；94℃变性，30 s；退火温度(见表1)，30 s；72℃延伸，30 s；35个循环；72℃继续延伸8 min；扩增产物4℃保存。

PCR扩增产物在2.5%琼脂糖凝胶电泳，120 V，30 min。

分别位于北京、浙江、广东的3家实验室用同样的12个微卫星位点对6份实验小鼠DNA模板进行PCR扩增和电泳。北京实验室电泳使用100 bp DNA ladder,浙江和广东实验室电泳使用DL500 DNA marker。

1.3.4 测序[7]

对PCR扩增结果进行STR扫描测序。

1.4 统计学方法

对测序结果进行统计分析。所用软件POPGENE 1.32和PIC Calc 0.6。

2 结果

北京、浙江和广东的3家实验室分别获得清晰电泳条带，获得等位基因数72个。其中D16Mit9位点在6只C57BL/6 J小鼠获得一致的143 bp的等位基因片段。D12Nds11位点在6只C57BL/6 J小鼠获得一致的174 bp的等位基因片段。详见图1A～1F，图2A～2F和图3A～3F测序结果表明3家实验室获得片段大小一致的等位基因。12个微卫星位点在6只实验小鼠的等位基因片段长度见表2。

3 讨论

微卫星标记检测法是国内外通用的实验动物遗传质量评价手段。国外实验室对于实验动物遗传质量的控制主要采取微卫星DNA标记检测法和SNP方法[8-9]，为满足国际合作与交流的需要，本研究验证了本实验室建立的微卫星标记检测法在实验动物遗传质量检测领域应用的可行性以及可重复性。

基于微卫星标记检测法的重要性，近些年来，已有科研人员在微卫星方法的建立及应用方面开展过一些研究。周建华等人[10]采用14个微卫星DNA标记技术对福建猕猴与河南猕猴遗传多样性进行分析。刘丽等人[11]利用微卫星分子标记技术，分析祁连山东段高寒草甸区小尺度下4个高原鼢鼠种群的遗传多样性和遗传结构特点。卫振等人[12]从400对微卫星引物中筛选得到51对分辨率高的引物用于豚鼠的常规检测研究。李银银等人[13]利用30个微卫星位点对国内24个近交系实验小鼠进行遗传状况分析。范涛等人[14]应用30个微卫星位点对4种不同来源高度免疫缺陷小鼠微卫星DNA 遗传检测的分析。郭羽等人[15]应用微卫星技术对两个来源的NIH实验小鼠进行群体遗传结构分析。微卫星技术在实验动物品系鉴定和群体结构分析方面应用广泛。

但是之前建立的方法，没有进行方法重复性研究，极大地限制了微卫星方法在实验动物遗传质量控制方面的应用。本研究侧重于微卫星标记检测法在3家实验室的重复性研究。选择位于北京，浙江和广东的3家实验室应用12个微卫星位点对6只实验小鼠进行遗传质量检测，研究结果表明，扩增条带与标准规定一致，微卫星标记检测法可以实现对实验动物的遗传质量评价，并在不同实验室获得较好的重复性。本研究成果丰富了我国的实验动物遗传质量监测手段，为团体标准[5]升级为国家标准提供合理依据，保障国际交流与合作的顺利开展。

表2 6只小鼠在12个微卫星位点的等位基因片段大小Table 2 Length of alleles of the six mice using 12 microsatellites

注：A：D16Mit9位点电泳结果；B：D12Nds11位点电泳结果；C：小鼠样本1～3的D16Mit9位点测序结果；D：小鼠样本4～6的D16Mit9位点测序结果；E：小鼠样本1～3的D12Nds11位点测序结果；F：小鼠样本4～6的D12Nds11位点测序结果。图1 北京实验室在D16Mit9和D12Nds11位点电泳结果图和测序结果图Note. A: Electrophoresis result of D16Mit9; B: Electrophoresis result of D12Nds11; C: Sequencing result of D16Mit9 in samples 1-3; D: Sequencing result of D16Mit9 in samples 4-6; E: Sequencing result of D12Nds11 in samples 1-3; F: Sequencing result of D12Nds11 in samples 4-6.Figure 1 Electrophoresis images and sequencing results of D16Mit9 and D12Nds11 in the Beijing laboratory

注：A：D16Mit9位点电泳结果；B：D12Nds11位点电泳结果；C：小鼠样本1～3的D16Mit9位点测序结果；D：小鼠样本4～6的D16Mit9位点测序结果；E：小鼠样本1～3的D12Nds11位点测序结果；F：小鼠样本4～6的D12Nds11位点测序结果。图2 浙江实验室在D16Mit9和D12Nds11位点电泳结果图和测序结果图Note. A: Electrophoresis result of D16Mit9; B: Electrophoresis result of D12Nds11; C: Sequencing result of D16Mit9 in samples 1-3; D: Sequencing result of D16Mit9 in samples 4-6; E: Sequencing result of D12Nds11 in samples 1-3; F: Sequencing result of D12Nds11 in samples 4-6.Figure 2 Electrophoresis images and sequencing results of D16Mit9 and D12Nds11 in the Zhejiang laboratory

注：A：D16Mit9位点电泳结果；B：D12Nds11位点电泳结果；C：小鼠样本1～3的D16Mit9位点测序结果；D：小鼠样本4～6的D16Mit9位点测序结果；E：小鼠样本1～3的D12Nds11位点测序结果；F：小鼠样本4～6的D12Nds11位点测序结果。图3 广东实验室在D16Mit9和D12Nds11位点电泳结果图和测序结果图Note. A: Electrophoresis result of D16Mit9; B: Electrophoresis result of D12Nds11; C: Sequencing result of D16Mit9 in samples 1-3; D: Sequencing result of D16Mit9 in samples 4-6; E: Sequencing result of D12Nds11 in samples 1-3; F: Sequencing result of D12Nds11 in samples 4-6.Figure 3 Electrophoresis images and sequencing results of D16Mit9 and D12Nds11 in the Guangdong laboratory