pH,Na+和Ca2+对大豆种皮果胶类多糖乳化稳定性的影响

赵玲玲 张红运 范宏亮 杨艳萍 王胜男 杨立娜 李 君 何余堂 朱丹实 刘 贺

(渤海大学食品科学与工程学院1，锦州 121013)(吉林大学食品科学与工程学院2,长春 130000)

大豆种皮是大豆深加工中最大的副产物，占整个大豆总质量的8%，具有价格低廉、贮存容易、果胶含量较高等特点[1]。与工业化生产的大豆水溶性多糖相比，大豆种皮果胶类多糖具有优良的凝胶、乳化、增稠等特性[2]。

大豆种皮果胶类多糖主要由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、多聚半乳糖醛酸等组成[3]，果胶类多糖结构中含有疏水基团，可与蛋白质在油-水界面结合形成空间位阻，具有较好的乳化稳定性[4]。在乳化过程中，疏水性的多糖在油-水界面具有强烈的吸附能力或直接与蛋白质络合[5]，同时通过增加乳液的黏性以防止乳液液滴重力分离从而形成稳定乳液[6]。赵丽[7]采用不同方法提取大豆皮多糖并分析多糖性质，发现微波辅助草酸铵提取大豆皮多糖制成乳液黏度大，粒度分布均匀，稳定性好。但乳液稳定性不仅与多糖本身(酯化度、分子量等)及浓度有关，还受pH、离子强度等外源性因素影响[8]。调节pH及添加金属离子可中和多糖自身电荷或改变其分子形态。Akihiro等[9]研究发现不同pH值提取可溶性大豆多糖的乳化性能差异显著。Makoto 等[10]通过对比甜菜果胶(SBP)，大豆可溶性多糖(SSPS)和树胶(GA)的乳化性能，发现SSPS在较高pH及盐浓度范围下，乳液稳定性降低。目前关于大豆种皮果胶类多糖乳化稳定性研究较少，更缺乏关于pH,Na+和Ca2+对SHPP稳定乳液能力影响的信息，所以本研究探索pH和盐浓度对用SHPP制备乳液稳定性的影响，从而进一步推动SHPP在食品工业中的应用及饮料产品开发。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆种皮；大豆色拉油；草酸铵、乙醇、HCl、NaOH：分析纯。

1.2 仪器与设备

PHS-3C pH计；Discovery DHR-1 TA流变仪；尼康80I光学显微镜；HYL-108激光粒度仪；RE3000旋转蒸发器；DHG-9055A电热鼓风干燥箱；SL-250A高速多功能粉碎机。

1.3 方法

1.3.1 SHPP制作工艺流程

将大豆种皮除杂，粉碎后过60目筛。称取大豆种皮100 g，按料液比1∶20加入1%的乙醇溶液，室温搅拌30 min，过滤，放置65 ℃恒温干燥箱中烘干。称取烘干后的大豆皮残渣，按料液比1∶20加入0.6%的草酸铵，在微波功率320 W作用20 min，取上清液。将上清液4 000 r/min条件下离心10 min，将离心后的液体浓缩至原体积的1/3，调节pH至4。加入无水乙醇使乙醇含量达到70%，于4 ℃下放置2 h后，在25 ℃，4 000 r/min条件下离心30 min。将获得的沉淀于65 ℃恒温干燥箱中烘干[11]。

1.3.2 乳液的制备

配制100 mL乳液，首先用大豆分离蛋白溶液与大豆油混合，利用高速剪切机在10 000 r/min下剪切2 min，制成初级溶液。配制SHPP水溶液，继续利用高速剪切机在10 000 r/min下剪切2 min，与初级溶液完全混合，最终使乳液包含20%油，3%大豆分离蛋白和2% SHPP，向最终乳液中添加0.02%叠氮化钠来抑制微生物生长，制成的乳液4 ℃下储存，备用[12]。

1.3.3 环境因素对SHPP乳化性质的影响

1.3.3.1 pH对乳液稳定性的影响

调节乳液的pH值(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0)，以未对溶液进行pH调节的溶液作为空白对照并对其稳定性进行分析，探讨pH值对乳液稳定性的影响。

1.3.3.2 阳离子存在对乳液稳定性的影响

Dario等[13]研究大豆皮可溶性多糖(HSPS)的乳化性能时，发现乳液含有0.2 mol/L Na+和0.05 mol/L Ca2+时液滴粒径最小，乳化稳定性最好。本实验借鉴Dario M.Cabezas的实验结果，将0.2 mol/L的氯化钠溶液和0.05 mol/L的氯化钙溶液与SHPP水溶液混合，制成乳液后对其进行分析，重点讨论0.2 mol/L Na+、0.05 mol/L Ca2+存在对乳液稳定性的影响。

1.3.4 总糖及蛋白质含量测定

总糖含量采用苯酚-硫酸法[14]，以葡萄糖为标准，在490 nm波长处测定。蛋白含量根据 GB/T 50095-2010 食品安全国家标准—食品中蛋白质的测定。

1.3.5 粒径分布的测定

采用激光粒度分布仪测定乳液粒径[15]，取200 μL乳液加入激光粒度分布仪进行分析，参数设定为：激光波长633 nm，散射角度90°，温度25 ℃，颗粒吸收率0.001，颗粒折射率1.52；遮光率范围为5～20，折射率1.333。

1.3.6 流变分析

稳态流变分析：采用DHR-1旋转流变仪测定，取1 mL乳液加在测试台上，于25 ℃条件下采用40 mm平行板夹具，狭缝距离设置为0.5 mm，剪切速率0～200 s-1，检测样品流变特性[16]。

振荡流变分析：将1.5 mL乳液加在测试台上后，进行动态频率扫描，扫描频率范围设定为0.01～3 Hz，检测整个过程的模量变化。40 mm平行板夹具，狭缝距离为0.5 mm，应力为1.0 Pa，所有的测量均在25 ℃下进行，实验过程中加盖密封圈以避免水分过度蒸发[17]。

1.3.7 光学显微观察

将乳液稀释10倍后，滴于载玻片上，待液滴均匀铺展，为避免气泡产生，将盖玻片轻轻覆盖于乳液液滴表面，置于(10倍、100倍)光学显微镜下观察液滴的形态[18]。

1.3.8 脂肪上浮率

脂肪上浮率的测试参照 Karimi 等[19]的方法，略有改动。吸取 10 mL 刚制备的乳液样品于玻璃管中(直径1.5 cm，高度12 cm)，并用塑料盖密封，防止乳液挥发。同时记录不同条件下乳液的清液层高度(Hs，下层)和总高度(Ht)。

脂肪上浮率(CI)定义为：CI=(Hs/Ht)×100%

1.4 数据处理

每个实验均重复3次，结果表示为平均数±标准差，用SPSS19.0 统计软件进行方差分析，以P<0.05为显著性检验标准。用origin8.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 总糖及蛋白质含量

测定SHPP总糖含量约为52.09%，蛋白含量约为6.93%。

2.2 pH对乳液稳定性的影响

2.2.1 pH对乳液粒径的影响

如表1所示，pH值对乳液的粒径有显著影响(P<0.05)。随着pH值升高，乳液D3,2和D4,3逐渐减小，当pH值达到4.0时最小。当pH>4.0，乳液的D3,2和D4,3逐渐升高。当pH<4.0，乳液pHpI，蛋白质自身带静电或负电，与阴离子多糖形成较弱的可逆复合物，两者间从静吸引到静排斥[21]，油滴表面吸附层结构不致密，颗粒粒径增大，乳液稳定性减弱。

表1 不同pH对乳液平均粒径的影响

注：每列标注不同小写字母表示存在显著差异P<0.05。

2.2.2 pH对乳液流动特性的影响

图1 不同pH对乳液黏度和剪切应力的影响

液滴粒径大小、连续相的黏度及组成成分等都可影响乳液流变学性质[22]。如图1所示，乳液的表观黏度均随着剪切速率增大而显著降低，即出现剪切稀化现象。当乳液pH值为4.0时，乳液黏度及剪切应力值最高。图2中的储能模量及损耗模量分别反映材料的弹性及黏性大小，其中pH值为6.0，7.0时弹性及黏性较差。反之，pH值为4.0时弹性及黏性最好有利于乳化稳定性增强。在pH值为4.0时，由于大豆蛋白的等电点在4.5左右[23]，SHPP可吸附在蛋白表面形成厚厚的界面膜，致使过剩带相反电荷的SHPP游离在水相中，且水中游离大量H+，导致-COO-数目减少，SHPP彼此间排斥力减小而团聚，乳液的黏度增大[24]。随着pH逐渐增大，乳液中OH-增加，一方面OH-与SHPP相互吸引，使多糖分子形态发生改变，另一方面多糖分子自身水解，与H+结合，导致乳液黏度减小，稳定性降低[25]。

图2 不同pH对乳液储能模量和损耗模量的影响

2.2.3 pH对乳液微观结构的影响

从图2可直观看出，当pH值为3.0、4.0时乳化颗粒均呈较为规则的圆形，此时，乳液稳定性较好，pH值为5.0时乳化颗粒呈大小不均一的圆形，pH值为6.0、7.0时乳化颗粒呈现较不规则的椭圆形，当pH值为4.0时，如图2所示，此时乳液的黏弹性最好，在均质过程中，由于增加连续相的黏度，同时增加剪切应力，可以让液滴碰撞频率降低，乳液粒径减小且不易聚集，形成较规则的圆形[26]，在pH高于5.0时，SHPP与界面上的蛋白不发生静电吸附而彼此排斥，SHPP离开界面而游离在水相中，SHPP无法为蛋白提供足够的静电及空间位阻屏障，所以蛋白可发生部分疏水聚集，从而导致液滴间相互聚集，乳化颗粒变大，影响乳液的乳化稳定性[27]。Li[28]利用壳聚糖包埋β-乳球蛋白质稳定的乳液在pH 3.0～6.0范围内均能够维持良好的乳化稳定性，而pH高于6.0时相对不稳定，与本研究结果相似。

注：a-e分别表示pH为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0时油镜100倍下观察得到的微观图，照片标尺为10 μm；A-E分别表示同等操作物镜10倍下得到的微观图，照片标尺为100 μm。图3 不同pH对乳液微观结构的影响

2.2.4 pH对乳液分层稳定性的影响

从图4可知，乳液 pH值为4.0时脂肪上浮率最小。在pH值3.0～4.0范围内，随着溶液pH值升高，乳液的分油率随之降低，pH<4.0时，低于多糖的侧链基团的解离常数pKa，—COO-基团部分质子化，导致液滴间静电斥力减小，油滴发生团聚，上浮[29]。随着 pH 升高接近蛋白等电点，蛋白质分子本身聚集的趋势增加，但由于SHPP可与蛋白产生空间排阻及SHPP彼此间会产生静电排斥，抑制油滴聚集[30]。在pH值4.0～7.0范围内，随着pH值升高，乳液的脂肪上浮率逐渐增大，乳液的稳定性逐渐下降，pH值达到6.0时趋于平缓。

2.3 阳离子存在对乳液稳定性的影响

2.3.1 阳离子存在对乳液粒径的影响

从表2可知，与未加阳离子的乳液相比，不同阳离子对乳液粒径有显著影响(P<0.05)。向乳液中添加0.2 mol/L Na+，乳液D4,3和D50分别为74.52 μm和47.62 μm，大于未加阳离子的乳液，说明添加高浓度的Na+可促进液滴的絮凝和聚集，可能是高浓度阳离子游离在水相，带相反电荷的离子在SHPP和蛋白表面积累，通过屏蔽蛋白和SHPP自身带电量，降低了彼此间的静电吸引力，同时，大量的盐离子加入到体系中蛋白会发生盐析而沉淀[31]，导致粒子变大。乳液中添加0.05 mol/L Ca2+，乳液的平均粒径略大，Ca2+的存在，一方面可降低蛋白的溶解度，另一方面可与SHPP分子局部交联，增加了SHPP分子的刚性，液滴之间更容易发生沉淀聚集。但是，由于添加Ca2+的浓度过低，可能只是屏蔽蛋白与SHPP的部分带电量，蛋白与多糖之间会继续发生静电吸附作用，同时液滴之间也会产生静电排斥，阻碍颗粒的进一步聚集，所以液滴粒径略有增大。

表2 阳离子对乳液平均粒径的影响

注：(1)每列标注不同小写字母表示存在显著差异P<0.05。(2)空白样为未添加阳离子的样品。

2.3.2 阳离子存在对乳液流变特性的影响

由图5可知，空白及含阳离子的乳液表观黏度均随着剪切速率增加而降低，表现出剪切变稀的流体特性，未添加阳离子时，乳液的黏度及剪切应力高于含Na+和Ca2+的乳液，含Ca2+的乳液起始黏度最低为0.56 Pa·s。图6反映出不含阳离子的乳液弹性及黏性相对较大。其原因可能在于Na+和Ca2+对SHPP的黏度行为具有很大影响，多糖的特性黏度受多糖分子间的静电相互作用而降低，Na+、Ca2+作为反离子与SHPP分子中的羧基相互作用，改变了多糖分子的构象，受到盐桥作用，使分子链由舒展到紧缩[32]。因此Na+和Ca2+存在会降低SHPP的黏度，从而降低其乳化稳定性。

图4 不同pH对乳液分层稳定性的影响

图5 阳离子存在对乳液黏度和剪切应力的影响

图6 阳离子存在对乳液储能模量和损耗模量的影响

2.3.3 阳离子存在对乳液微观结构的影响

由图7可知，未添加阳离子乳液的乳化颗粒均呈较为规则的圆形，而添加Na+和Ca2+乳液的乳化颗粒呈现较不规则的椭圆形，乳化颗粒大小：B>C>A，与表2结果一致。因为Na+和Ca2+带正电荷，而SHPP自身带负电荷，随着乳液中带相反电荷的离子增加，屏蔽多糖自身的带电量，从而减小分子与分子间的静电斥力，液滴间发生聚合，同时，盐的相互作用会促进产生絮凝，有效的降低蛋白质的溶解度，由于形成一个三维的聚合液滴网络进而阻碍乳化过程[33]，因此，阳离子存在可降低乳液乳化稳定性。

注：a-c分别表示乳液中未添加阳离子、添加Na+、Ca2+时油镜100倍下观察得到的微观图，照片标尺为10 μm；A-C分别表示同等操作物镜10倍下得到的微观图，照片标尺为100 μm。图7 阳离子存在对乳液微观结构的影响

2.3.4 阳离子存在对乳液分层稳定性的影响

如图6所示，未添加阳离子时，乳液的脂肪上浮率最低为37%，向其中添加Na+，脂肪上浮率最高为56%，此时由于大量盐离子存在，使水的活度降低，蛋白表面的疏水残基充分暴露，蛋白与蛋白发生聚而沉淀[34]，同时油滴界面电荷减少，油滴与油滴聚集，由于重力作用，油脂上浮析出。向其中添加Ca2+时脂肪上浮率为38%，说明0.05 mol/L Ca2+的存在对乳液乳化稳定性影响不显著，可能由于Ca2+是高价离子，屏蔽蛋白和SHPP的部分电荷，使蛋白与多糖之间静电斥力减弱，但粒子与粒子间仍然存在静电互斥作用，所以有效缓解了油滴的上浮。

图8 阳离子存在对乳液分层稳定性的影响

3 结论

大豆种皮果胶类多糖具有良好的乳化性质，其乳化稳定性随pH值和阳离子存在的变化差异显著。pH 4.0时，乳化颗粒粒径最小，黏度及剪切应力最大，脂肪上浮率最低，乳化性最佳。添加0.2 mol/L Na+可促使乳液乳化稳定性降低，而添加0.05 mol/L Ca2+对降低乳液乳化稳定性作用较小。本研究结果表明，SHPP在酸性介质中可吸附在油-水界面形成黏弹性膜，因此可用作酸性O/W乳液中有效的乳化剂，同时，应避免添加金属离子屏蔽SHPP自身带电量。