芬顿氧化降解法制备低分子质量亚麻籽胶-铁复合物的研究

杜木香 梁 珊 黄 玉 庄晓慈 李爱军 汪 勇

(广东油脂生物炼制工程技术研究中心；暨南大学食品科学与工程系；暨南大学-萨斯喀彻温大学“油料生物炼制与营养”联合实验室，广州 510632)

亚麻籽胶(Flaxseed gum)，又名富兰克胶、胡麻胶，是一种以多糖为主要成分的天然植物种子胶[1]，常作为增稠剂、凝胶剂、乳化剂、保湿剂等应用于食品、日化及医药行业[2]。亚麻籽胶的主要成分亚麻籽多糖是由5～7种单糖通过一系列特异性糖苷键连接而成的大分子聚合物[3]，分子质量通常可达2 000 ku以上[4]，较高的分子质量赋予了亚麻籽胶类似于膳食纤维的作用，但同时也限制了其在胃肠道内的消化吸收。亚麻籽多糖分子可通过物理、化学或生物的方法被降解，得到小分子产物，从而提高其消化吸收效率[5]。笔者在研究芬顿氧化降解法降解亚麻籽胶时发现由于反应体系中铁离子的引入，使得产物形成了一种新型胶-铁复合物，可为制备新型无副作用膳食铁补充剂提供新的思路，因此进一步深入了芬顿氧化降解法制备低分子质量亚麻籽胶-铁复合物的研究。

芬顿反应是由Fe2+催化H2O2发生一系列复杂的自由基链式反应，反应过程中释放大量的羟基自由基，从而表现出很强的氧化降解能力[6]。芬顿反应主要在环境化学中应用于有机废水的处理，对氰化物、酚类物质、芳香族化合物等表现出很强的清除能力，也可用于降解有机高分子聚合物(多糖、蛋白等)[7]，因此可用于大分子亚麻籽胶的降解。在降解亚麻籽胶的反应体系中，亚麻籽胶被降解产生低分子质量多糖基产物，Fe2+被氧化产生Fe3+，Fe3+进一步与低分子质量多糖基物质结合，形成了稳定的低分子质量亚麻籽胶-铁复合物[LMWFG-Fe(Ⅲ)]。铁是人体必需的一类微量营养元素，对维持机体正常代谢十分重要，尤其是酶的表达、免疫系统调控以及电子传递等，铁缺乏易造成缺铁性贫血(iron-deficiency anemia,IDA)，进而造成机体功能紊乱，罹患各种疾病[8]。

目前临床上用于治疗IDA的药物主要是硫酸亚铁制剂，但游离Fe2+在机体内可产生内源性自由基，造成细胞氧化损伤，还有较大的胃肠刺激性，不利于铁的消化吸收[9]。因此近年来以多糖铁为代表的新型复合物补铁剂引起了人们的广泛关注。多糖铁以三价铁(Fe3+)为核心，铁元素以稳定的配合物形式存在，对胃肠道无或甚少刺激作用，在体内释放后会被还原成二价铁(Fe2+)后吸收利用[10]。多糖铁具有副作用小、配合性稳定、溶解度好、含铁量高等优点，可为IDA的治疗提供新的解决方案[9-11]。但以胶类物质为铁受体的复合物则鲜有报道，尤其是低分子质量胶-铁复合物的研究。因此，本实验聚焦于芬顿氧化降解法制备LMWFG-Fe(Ⅲ)的研究，并对其进行了分离纯化、理化性质表征以及体外模拟释放动力学的研究，旨在拓展亚麻籽胶的应用深度，并为治疗IDA提供新的解决方案。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

亚麻籽胶；双氧水(30%)、七水合硫酸亚铁、乙酸、乙酸钠、1,10-邻菲罗林、抗坏血酸、3,5-二硝基水杨酸、酒石酸钠、苯酚、硫酸，均为分析纯；葡聚糖标准品，分子质量分别为1 100、150、50、1 ku；模拟胃液：2 g NaCl、7 mL HCl、3.2 g胃蛋白酶溶解于1 L水中制备得到[12]。

1.2 仪器与设备

DF-101S型集热式磁力搅拌器；722s型紫外可见分光光度计；LC-20AD高效液相色谱仪；Scientz-10N 型冷冻干燥机；VERTEX70型傅里叶红外光谱仪；Miniflex600型X射线衍射理学仪。

1.3 实验方法

1.3.1 芬顿氧化法降解亚麻籽胶实验条件的确定

1.3.1.1 单因素实验设计

研究双氧水添加量、Fe2+添加量、pH、温度、反应时间对亚麻籽胶降解率的影响。将亚麻籽胶溶于特定pH的缓冲液中(醋酸-醋酸钠缓冲液，NaAc-HAc)，磁力搅拌状态下依次加入双氧水、硫酸亚铁溶液，控制特定的温度和反应时间，反应在DS-101S集热式恒温加热磁力搅拌器中进行，反应过程中用磁力搅拌子不断搅拌，反应结束后测总糖及还原糖含量[13-14]，以还原性末端糖基得率按式(1)计算亚麻籽胶降解率[15]。

(1)

1.3.1.2 正交实验设计

由于亚麻籽胶在芬顿氧化降解过程中不仅受到双氧水添加量、Fe2+添加量、pH、温度、反应时间的单独影响，而且这些因素之间还存在复杂的交互作用，因此在单因素实验的基础上设计四因素三水平L9(34)正交实验，以确定最佳降解条件。

1.3.2 大孔树脂分离纯化降解产物

降解产物经真空抽滤除去未降解大分子，得到降解糖液。由于原料亚麻籽胶属天然植物提取物，因此降解糖液中疑似含有黄酮、皂苷、生物碱等非糖成分，这对产品的后期分析会产生一定影响，因此采用HZ-814大孔树脂进行纯化处理[16]，进行动态吸附实验，以糖保留率、铁保留率以及脱色率为评价指标，分别研究上样浓度、洗脱速度以及洗脱液体积对纯化效果的影响。大孔树脂吸附结束后进行旋转蒸发浓缩，真空冷冻干燥，得到LMWFG-Fe(Ⅲ)。

1.3.3 铁的定性鉴别及含量测定

1.3.3.1 定性鉴别

以蒸馏水溶解样品，得到1 mg/mL的样品溶液，然后分别采用硫氰酸钾及亚铁氰化钾根据现象变化及颜色反应定性鉴别Fe3+及Fe2+，滴加硫氰酸钾后溶液变红表明有游离Fe3+，滴加亚铁氰化钾后有蓝色沉淀产生表明有游离Fe2+。

1.3.3.2 定量测定[17]

取适量样品加1 mol/L HCl充分溶解，适当稀释后取1.0 mL，先后加入1 mL水、1 mL 10%的盐酸羟胺溶液、1 mL 0.25%的邻菲罗林溶液、6.0 mL pH4.5的NaAc-HAc缓冲液，充分混匀，室温下放置15 min后以蒸馏水为参比测510 nm下吸光度值，然后根据吸光度和硫酸亚铁铵标准曲线计算得到总铁含量。以蒸馏水代替HCl溶解样品的处理组测量得到游离Fe2+含量。

1.3.4 LMWFG-Fe(Ⅲ)的表征

1.3.4.1 分子质量的变化

采用凝胶渗透色谱法(GPC)评价芬顿氧化降解前后亚麻籽胶相对分子质量的变化。采用岛津液相LC-20AD高效液相色谱仪，TSKgel G6000 PWXL单柱分析，ELSD检测器(漂移管温度110 ℃，气流速度3.0 L/min)，流动相为纯水，流速为1.0 mL / min，柱温40 ℃，分析时间20 min。以葡聚糖标准品(分子质量分别为1 100、150、50、1 ku)为对照。

1.3.4.2 红外光谱(FTIR)表征

采用FTIR探究亚麻籽胶及LMWFG-Fe(Ⅲ)的结构特征。取1.0 mg左右的样品及原料亚麻籽胶，采用溴化钾压片法充分碾磨后制成薄片上机测定，红外光谱扫描范围为4 000～400 cm-1。

1.3.4.3 X射线粉末衍射(XRD)

采用XRD探究亚麻籽胶及LMWFG-Fe(Ⅲ)的晶体结构。采用Cu靶，Kα辐射源，X射线粉末衍射系统，10°～80° 2θ连续扫描，扫描速度为5(°)/min，电压40 kV，电流40 mA，分别测定亚麻籽胶及LMWFG-Fe(Ⅲ)的XRD图谱。

1.3.5 LMWFG-Fe(Ⅲ)体外模拟释放动力学研究

分别称取LMWFG-Fe(Ⅲ)样品100 mg以及30 mg Fe2(SO)4于15 mL试管中，加入10 mL模拟胃液，漩涡振荡混匀2 min后转移至透析袋中(截留分子质量3 500 u)，置于含有200 mL模拟胃液的烧杯中，温和磁力搅拌，保持模拟消化体系温度为37 ℃，进行模拟消化，然后分别在特定时间从烧杯中取1.0 mL消化液进行铁含量的测定(取出后烧杯中补充1.0 mL模拟胃液)，计算铁释放率，然后以时间为横坐标，铁释放率为纵坐标做图，得到铁释放动力学曲线。根据所得到的数据按以下公式进行拟合，匹配动力学模型，得到相关参数，探究铁释放机理[18]。

零级模型:Mt/M∞=C0+k0t

(2)

一级模型: logMt/M∞=k1t/2.303+C1

(3)

Higuchi模型:Mt/M∞=kHt1/2+CH

(4)

Hixson-Crowell模型: (Mt/M∞)1/3=kHCt+CHC

(5)

Korsmeyer-Peppas模型:Mt/M∞=kKPtn

(6)

式中：Mt/M∞为t时刻铁的累积释放率；k0、k1、 kH、 kHC、 kKP为相应动力学模型的铁释放速率常数；C0、 C1、 CH、 CHC为拟合方程常数项；n为Korsmeyer-Peppas模型释放指数；t为时间。

2 结果分析

2.1 芬顿氧化法降解亚麻籽胶实验条件的确定

在其他反应参数固定的条件下，通过单因素实验，分别得到了各因素的最佳实验结果(图1)，即双氧水添加量为亚麻籽胶质量的10%，Fe2+添加量为双氧水摩尔量的1/2，温度为75 ℃，pH3.0，反应时间2.0 h。考虑到降解时间对反应结果的影响不大，因此在单因素实验结果的基础上，固定反应时间为2.0 h，选择双氧水添加量、Fe2+添加量、温度、pH进行4因素3水平[L9(34)]正交实验设计(见表1)，以确定芬顿氧化降解亚麻籽胶的最佳实验条件，正交实验结果见表2。根据正交结果分析，双氧水添加量对降解率影响最大，其次是pH，Fe2+添加量和温度对降解率的影响相对较小。芬顿氧化降解亚麻籽胶的最佳工艺条件为A2B2C3D2，即双氧水添加量为亚麻籽胶质量的10%，Fe2+添加量为双氧水摩尔量的1/2，温度为80 ℃，pH3.0。由于此条件在正交表中并未列入，故按此条件进行验证，测得亚麻籽胶降解率为47.83%，优于正交表中的实验值。

图1 芬顿氧化降解法单因素实验结果

水平因素双氧水添加量/%Fe2+添加量温度/℃pH161/3604.02101/2703.03141/1802.0

表2 正交实验结果

2.2 大孔树脂分离纯化效果评价

分别研究了上样浓度、洗脱速度以及洗脱液体积对纯化效果的影响。结果表明，在pH 3.0的条件下，HZ-814大孔树脂最佳吸附工艺条件为上样浓度10 mg/mL(相当于原料亚麻籽胶的质量浓度)、洗脱速度为3 mL/min、洗脱液(蒸馏水)体积为5倍柱体积，在此工艺条件下总糖保留率为83.42%，铁保留率为94%，脱色率为28.62%，最终洗涤液莫氏反应呈阴性(表明糖分已被完全洗脱)。大孔树脂吸附后得到的糖液为澄清透明的亮黄色，且旋蒸时起泡现象大大减小，表明皂苷、黄酮、生物碱等杂质被有效去除。

2.3 LMWFG-Fe(Ⅲ)中铁的定性及定量结果

按正交实验得到的最佳工艺条件降解亚麻籽胶，平行制备得到了5份LMWFG-Fe(Ⅲ)，产物中铁的定性及定量测定结果见表3。由表3可知，加入硫氰酸钾后溶液颜色无明显变化，而加入亚铁氰化钾后溶液有少许蓝色沉淀产生，表明LMWFG-Fe(Ⅲ)中铁的存在形式为结合态的Fe3+和少量的游离Fe2+，通过定量测定可知，5组LMWFG-Fe(Ⅲ)铁的定量平均值为：总铁8.97%，结合态Fe3+为7.86%，游离Fe2+为1.11%；产物平均得率为43.85%，总糖质量分数平均值为52.61%。产物中铁的这种存在形式有利于其在胃液中缓释，从而减轻游离铁的副作用。

表3 LMWFG-Fe(Ⅲ)中铁的定性及定量结果

2.4 LMWFG-Fe(Ⅲ)的表征

2.4.1 芬顿氧化降解前后分子质量的变化

根据GPC的分析原理，大分子先被洗脱，小分子洗脱时间滞后。因此，如图2a所示，原料亚麻籽胶的分子质量远大于1 100 ku(小的洗脱峰忽略不计)，经过芬顿氧化降解之后，亚麻籽胶的大分子单峰分解为四个分子质量较小的峰(洗脱时间滞后)，其中第一个峰分子质量仍在1 100 ku以上，但峰面积较小，第二及第三个峰分子质量介于50～150 ku，第四个面较大的峰分子质量在1 ku左右。分子质量测定结果表明亚麻籽胶经降解得到的LMWFG-Fe(Ⅲ)分子质量明显减小。

2.4.2 红外光谱分析

图2 LMWFG-Fe(Ⅲ)的表征

2.4.3 XRD分析

如图2c所示，LMWFG-Fe(Ⅲ)与原料亚麻籽胶的XRD图谱存在较大差异。对于亚麻籽胶，在2θ=21.6°时有一个宽峰，表明亚麻籽胶呈现出无定形态即非晶体结构，而LMWFG-Fe(Ⅲ)在22θ=19.9°、21.1°以及29.3°出现了3个尖锐的吸收峰，这表明铁离子与低分子质量亚麻籽胶结合后产生了新的化合物，信号分别归属于α-Fe2O3,Fe3O4以及α-FeOOH[23]。这也表明低分子质量亚麻籽胶中的羟基或羧基参与了与铁离子的缔合作用，从而形成了新的铁化合物晶体网络结构。

2.5 LMWFG-Fe(Ⅲ)中Fe3+的体外模拟释放动力学

胃液是铁消化吸收的重要环境，因此本实验研究了LMWFG-Fe(Ⅲ)在模拟胃液中的对Fe3+的缓释效果，以游离铁盐Fe2(SO4)3为对照，铁释放曲线如图3所示，由图可知，在相同的时间点，LMWFG-Fe(Ⅲ)中Fe3+的释放率远低于游离铁盐Fe2(SO4)3，例如在3.0 h时，LMWFG-Fe(Ⅲ)以及Fe2(SO4)3中Fe3+的释放率分别为49.89%以及79.78%，经过5.0 h的模拟消化后，实验组以及对照组的Fe3+累积释放率分别为55.90%以及92.92%，这表明LMWFG-Fe(Ⅲ)在模拟胃液中能够很好地起到缓释Fe3+的作用，可潜在制备成一种新型无副作用的膳食铁制剂。对释放曲线进行动力学方程拟合，结果如表4所示，根据最佳拟合R2值可知，LMWFG-Fe(Ⅲ)及Fe2(SO4)3中Fe3+释放动力学均符合Korsmeyer-Peppas模型，n值分别为0.594 6和0.637 0。对于球状药物颗粒，当n≤0.43时，释放机制属于费克扩散，当0.43

图3 LMWFG-Fe(Ⅲ)及Fe2(SO4)3中Fe3+铁释放曲线

动力学模型LMWFG-Fe(Ⅲ)R2knFe2(SO4)3R2kn零级0.8890.0881—0.92730.1552—一级0.77430.2579—0.82180.2821—Higuchi0.96070.2769—0.98010.4822—Hixson-Crowell0.81870.0593—0.86370.0759—Korsmeyer-Peppas0.96590.24020.59460.98270.36630.637

3 结论

芬顿氧化降解法可有效降解亚麻籽胶得到低分子质量亚麻籽胶铁复合物，在最优反应条件下，亚麻籽胶降解率可达47.83%，LMWFG-Fe(Ⅲ)得率为43.85%，总糖质量分数为52.61%，亚麻籽多糖分子由原来的大分子质量单峰转变为4个小分子质量峰，产物的总铁质量分数为8.97%，且大多以结合Fe3+形式存在。铁离子与低分子质量亚麻籽胶中的羟基或羧基之间以共价或配位结合的形式形成了稳定的晶体网状结构。LMWFG-Fe(Ⅲ)在模拟胃液中能够有效缓释Fe3+，释放动力学符合Korsmeyer-Peppas模型，释放机制属于非费克扩散。