胃癌患者化疗药物体外敏感性的相关性研究*

赵法之，肖硕萌，赵 平，丁 志，周 祥，唐令超，陈小东,2△

(1.四川省肿瘤医院胃肠外科中心，成都 610041；2.电子科技大学医学院，成都 610054)

胃癌是我国最常见的消化系统恶性肿瘤类型，据2017年发布的中国胃癌流行病学资料显示，我国胃癌的发病率为31.28/10万，病死率为22.04/10万[1]。我国的胃癌患者早期诊断率低，就诊时多数已属进展期，这部分患者除手术切除外通常需要进行围术期化疗。有研究显示，根治性手术术后开展化疗较单独手术治疗，患者的总生存期及无病生存期延长，治愈率提高[2]。然而术后辅助化疗对患者生存期的延长有限，晚期胃癌对化疗药物的反应率不超过50%[3]。目前已经发现胸苷酸合成酶(thymidylate synthase，TYMS)、切除修复交叉互补基因1(excision repair cross complementation group 1,ERCC1)、乳腺癌易感基因1(breast cancer susceptibility gene 1,BRCA1)及3型β微管蛋白(β-tubulin-Ⅲ,TUBB3)等与特定化疗药物反应性有关[4-7]。因此本研究收集胃癌切除手术患者资料，探究胃癌患者临床病理特征、化疗相关基因表达水平与化疗药物敏感性的相互关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2015年1月至2016年2月四川省肿瘤医院胃肠外科行根治性胃癌切除手术患者。纳入标准：(1)所有患者术前均行胃镜检查并取镜下病理活检查见肿瘤；(2)无肿瘤远处转移。排除标准：术前或术中评估肿瘤无法切除，包括已发生肠系膜根部、腹腔干等大血管侵犯、腹主动脉旁第16组淋巴结转移、腹膜种植或远处转移。共纳入127例胃癌患者，其中男95例，女32例，平均年龄(58.0±10.7)岁，中位年龄60岁。患者入院时美国东部肿瘤协作组(ECOG)评分小于或等于2分，患者提供的主观整体营养状况量表(PG-SGA)评分小于或等于3分。肿瘤病理资料：肿瘤平均径线为(5.7±3.2)cm，中位径线为5.0 cm，胃下部肿瘤(胃窦为主)65例(51.2 %)。大体病理Bormann分型以Ⅱ、Ⅲ型最多。按美国癌症联合委员会(AJCC)分期(第7版)标准进行 TNM分期，Ⅰ期患者8例，Ⅱ期患者23例，Ⅲ期患者86例，Ⅳ期患者10例。组织病理类型15例为印戒细胞癌，其余为腺癌，腺癌中67例为低分化。肿瘤组织Her-2检测结果阳性患者占比46.9%。

1.2方法

1.2.1肿瘤相关基因mRNA检测 采用分支DNA液相芯片技术(益善生物技术股份有限公司)定量检测目的mRNA表达，包括TYMS、ERCC1、BRCA1、TUBB3共4项。主要操作流程为：(1)取肿瘤组织石蜡切片加入裂解液，56 ℃下裂解反应2 h，检测裂解液中总mRNA纯度。(2)将标本裂解液转移至孵育板上，加入支持探针-微球、支持延伸探针、缓冲液，孵育过夜，次日吸取弃去上清液并加入洗涤液，震荡洗涤 1 min后吸取弃去上清液，该步骤重复洗3次。(3)加入扩增延伸探针和标记探针，50 ℃震荡反应1 h后放在磁力架上1 min，吸取弃去上清液；用洗涤液洗2次。(4)加入链霉亲和素-藻红蛋白，50 ℃震荡反应30 min。(5)洗涤孵育3次，于Luminex 阅读仪上读取数据，得出检测结果。

1.2.2化疗药物敏感性检测 采用ATP肿瘤化疗敏感性检测(ATP-TCA)试剂盒(湖州海创生物科技有限公司)检测胃癌细胞对氟尿嘧啶(5-FU)、顺铂(DDP)、奥沙利铂(OX)、紫杉醇(PTX)及多西他赛(DOC)的体外化疗敏感性。主要操作流程包括：(1)新鲜的胃癌标本取材后放入一次性的培养皿中，浸泡液及75%乙醇顺次浸泡并吹打1～2 min，取离心细胞加入含青霉素200 U/mL和链霉素200 U/mL的培养基中浸泡25 min后吸去浸泡液。(2)将前述处理后胃癌组织剪碎成糊状，加入含混合消化酶的培养基，2 h后于200目筛网过滤获得单细胞悬液，洗涤后台盼蓝染色进行活细胞计数。(3)将待测药物加入96孔培养板。所用药物及100%药物测试浓度(test drug concentration，TDC)参考药物在人体内的血浆浓度设定为： 5-FU 25.0 μg/mL、DDP 3.8 μg/mL、OX 5.0 μg/mL、PTX 3.6 μg/mL、DOC 3.7 μg/mL，联合用药的每个药物浓度与单药浓度相同[8-9]。每个药物设200%、100%、50%、25%、12.5% 5个TDC，每个TDC 2个平行孔，并设2排(8孔)无药孔作对照，一排为无药对照(M0)，一排为空白对照(M1)；仅200 μL完全培养基，作为检测本底值。(4)接种肿瘤细胞，在37 ℃、5% CO2条件下培养5 d后，每孔加入50 μL荧光素按试剂盒说明书操作测定荧光值。

1.2.3结果参数及敏感性判定标准 肿瘤相关基因mRNA表达由Luminex 阅读仪直接给出检测值。127例患者检测值取中位数为界值，小于或等于中位数测值为低，大于中位数测值为高。化疗敏感性ATP-TCA法检测结果由所测定的荧光值计算，计算指标包括肿瘤生长抑制率(tumor growth inhibition rate，TGI)、化疗敏感指数(chemosensitivity index，CSI)、IC50及IC90。各指标按下式计算：TGI=(1-药物处理孔荧光均值/无药对照孔荧光均值)×100%。CSI=500-各TDC的抑制率之和，其值越小表示该化疗药物对肿瘤细胞的抑制率高。IC50：抑制50%肿瘤细胞生长的TDC。IC90：抑制90%肿瘤细胞生长的TDC。化疗药物敏感性依据各化疗药物TDC、CSI、IC50及IC90分为：敏感，IC50≤25%TDC；轻度敏感，IC90≤100%TDC且IC50>25%TDC，或CSI≤300；耐药，IC90>100%TDC且IC50>25%TDC且CSI>300。

2 结 果

2.1患者化疗药物相关基因检测及化疗药物体外敏感性检测结果 127例患者TYMS、ERCC1、BRCA1、TUBB3共4种化疗相关基因mRNA表达中位测值(最值)分别为： 0.137(0.088，0.218)、0.614(0.475，0.727)、0.066(0.047，0.096)、0.068(0.038，0.126)。体外化疗反应性测定5-Fu、DDP、OX、PTX、DOX共5种化疗药物的中位CSI分别为：316(276，351)、316(284，358)、322(289，367)、197(124，257)、265(166，326)。不同化疗药物具有的化疗敏感性患者例数为(按：敏感、轻度敏感、不敏感顺序)：5-Fu 10、37、80例，DDP 5、40、82例，OX 4、37、86例，PTX 64、44、19例，DOC 43、39、45例。

2.2患者临床病理特征与化疗相关基因mRNA测值相关性 病理特征与化疗相关基因测值相关性分析显示胃下部肿瘤与ERCC1高表达、Bormann Ⅰ型患者与TUBB3高表达有关(P<0.05)，且肿瘤平均径线大于5 cm与 TYMS高表达有关(P<0.01)，见表1。

表1 患者临床病理特征与化疗相关基因检测

续表1 患者临床病理特征与化疗相关基因检测

a:P<0.05;b:P<0.01

2.3患者临床病理特征与CSI相关性 比较127例患者临床病理特征与CSI相关性，发现年龄大于或等于60岁与OX低CSI、胃上部肿瘤与OX低CSI、胃中部肿瘤与DOC低CSI及N分期2～3期与PTX低CSI有关(P<0.05)，见表2。

表2 患者临床病理特征与CSI的相关性

续表2 患者临床病理特征与CSI的相关性

a:P<0.05

2.4化疗药物相关基因与CSI、化疗药物敏感性的相关性 Pearson积矩相关系数检验化疗药物相关基因mRNA表达水平与对应药物CSI值的相关性，结果显示TYMS与5-FU、ERCC1与DDP/OX、BRCA1与DDP/OX、BRCA1与PTX/DOC、TUBB3与PTX/DOC相互间均未表现出相关性(P=0.846、0.917/0.994、0.107/0.522、0.100/0.092、0.816/0.504)。进一步将mRNA检测值按低表达与高表达进行二分类，采用Spearman等级相关分析行mRNA表达值与相应药物的CSI分析同样显示二者间未表现出相关性(P=0.989、0.800/0.876、0.180/0.633、0.425/0.306、0.810/0.792)。按前述比较分别将TYMS、ERCC1、BRCA、TUBB3基因mRNA检测值与相应化疗药物敏感性(敏感与轻度敏感、耐药)行相关性分析亦显示其之间无显著相关性(P=0.925、0.838/0.889、0.087/0.614、0.603/0.204、0.452/0.588)。相应地将不同基因mRNA检测值作二分类处理与对应化疗敏感性行相关性分析显示二者之间同样不具有显著相关性(P=0.620、0.975/0.904、0.260/0.810、0.372/0.588、0.645/0.465)，见表3。

表3 患者化疗药物相关基因mRNA表达与化疗敏感性关系(n)

a:包含敏感及轻度敏感;-：无数据

3 讨 论

对接受根治性手术切除的进展期胃癌患者，目前的观点认为除原发肿瘤切除外应联合D2站淋巴结清扫并选择性应用术后系统性化疗。经术后系统性化疗较单纯手术提高了患者的整体预后[8]。

5-Fu类联合铂类是术后系统性化疗推荐的一线用药方案，文献报道其有效率在30%～50%，而加用PTX类的3药方案有效性可以达到50%以上[9-10]。鉴于3药方案有更大不良反应，指南中并未将其作为常规推荐。不同胃癌患者基因、蛋白表达、临床病理特征等多个维度的异质性，导致了其对化疗药物、靶向治疗药物的反应差异巨大[3]。目前对化疗相关基因检测的研究已经取得了一定进展，但研究尚未取得一致结论。TYMS作用于DNA合成过程，是5-Fu抑制肿瘤生长作用靶点之一。体外研究显示TYMS表达水平与5-Fu类(5-Fu、卡培他滨、替吉奥等)药物化疗敏感性呈负相关[4]。本研究发现TYMS表达水平与5-Fu类药物敏感性并无明显相关性。这样的结果体现了胃癌分子病理上的异质性，TYMS表达影响5-Fu化疗敏感性可能与肿瘤基因型及不同信号转导途径参与有关，其有待进一步基因及分子层面的研究来阐明。ROGOZA等[11]研究显示TYMS表达水平与患者无病生存期呈正相关，且其在Lauren肠型、男性患者、胃中部及下部肿瘤患者中高表达。既往文献就ERCC1、BRCA1及TUBB3基因与胃癌化疗药物敏感性关系的研究结论较为一致。ERCC1是核苷酸外切修复家族的成员，参与DNA损伤修复过程。多项研究发现胃癌当中ERCC1表达水平与铂类药物化疗敏感性之间呈负相关[5,12]。近年对ERCC1及ERCC2的研究多集中在单基因多态性上，并发现特定基因型与化疗应答率低有关，但其临床价值尚需大样本量研究佐证。BRCA1是铂类药物所致DNA损伤的修复基因。其高表达与铂类药物的耐药有关。TUBB3基因编码的TUBB3则是抗微管药物的主要作用靶点，其阳性表达与预后呈现负相关。

研究中肿瘤平均径线大于5 cm、胃下部肿瘤及Bormann Ⅰ型患者可能分别对5-Fu类、铂类及紫衫类药物不敏感。但鉴于本研究化疗药物相关基因与化疗敏感性未表现出相关性，上述病理特征与化疗药物敏感性关系尚需结合生存期随访最终确定。韩杰等[13]研究发现消化道肿瘤患者年龄大于或等于65岁对5-Fu及OX不敏感，而OX、DDP、5-Fu及PTX对低分化腺癌有更好的敏感性。进一步的研究计划纳入更多患者临床资料并对其长期生存状况进行随访，以评估化疗药物的敏感性与预后的关系。