结直肠癌患者血浆中miR-141-3p及其靶基因的表达变化及相关性分析∗

张 同，施承民，徐 玉，舒 若，曾玉剑，孙 亮，田 衍，肖博凯，李 庆，王昆华，罗华友

(昆明医科大学第一附属医院/云南省消化病研究所/云南省消化道疾病防治工程技术研究中心胃肠与疝外科，昆明 650032)

结直肠癌是世界范围内病死率较高的消化道恶性肿瘤之一。近年来，小分子非编码RNA(microRNA,miR)在癌症调控方面的研究报道逐渐增多。miR在血浆中稳定存在，并在外周血差异性表达。miR-141-3p作为miR-200家族的一员，被报道参与了食管癌[1]、原发性肝细胞癌[2]、前列腺癌[3]、胶质瘤[4]、瘢痕瘤[5]、胃癌[6]和结肠癌[7]等肿瘤形成过程。有研究报道miR-141-3p在结直肠癌肿瘤组织中的表达下调[8-9]，也有研究报道miR-141-3p在结直肠癌肿瘤组织中的表达上调[10]。磷酸酶与张力蛋白同源物(PTEN)[1,11]、转化生长因子Ⅱ型受体(TGF-β2)[12-13]和肿瘤抑制蛋白p53[4]分别被报道为miR-141-3p的靶基因。本研究比较分析miR-141-3p及其靶基因在结直肠癌患者血浆中的表达差异，以及手术前后的表达变化，旨在为结直肠癌的早期诊断和治疗预后提供参考依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2011年12月至2014年12月本院接受手术治疗的结直肠癌患者150例作为试验组，术前均未行放疗或化疗等治疗，癌组织经镜检确诊为腺癌。同时选取150例健康志愿者作为对照组。试验组患者的平均年龄为(55.21±7.84)岁，其中男48例，女62例。对照组健康志愿者的平均年龄为(53.02±5.97)岁，其中男53例，女57例。所有对象均自愿签署知情同意书。两组年龄和性别比较，差异无统计学意义 (P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1手术方法及术后随访 试验组结直肠癌患者均采用腹腔镜和开腹结直肠癌根治术进行治疗[14-15]。术后3年平均每3个月随访1次，记录患者肿瘤复发、远处转移和死亡等情况。

1.2.2血浆标本采集 静脉抽取结直肠癌患者手术前血液，手术后第7天血液[16]和健康志愿者血液各2 mL。血液标本转入乙二胺四乙酸(EDTA)采血管，室温静置待血液完全凝固后，离心分离血浆。收集血浆至新的离心管，-80 ℃保存备用。

1.2.3血浆总RNA提取及反转录 各取400 μL上述血浆标本，按miRNeasy Serum/Plasma kit试剂盒(Qiagen)的方法步骤抽提血浆中的总RNA，利用荧光分光光度计(Thermo Fisher)测定血浆RNA浓度。提取的RNA置于-80 ℃保存备用。参照Taq-Man miRNA反转录试剂盒(Applied BioSystems)的说明反转录cDNA。

1.2.4miR-141-3p及其靶基因检测 参照GoTaq®qPCR Master Mix试剂盒(Promega)说明配置反应液，在ABI 7500实时荧光定量PCR(RT-qPCR)仪(Applied BioSystems)上对上述合成的cDNA进行RT-qPCR检测。每个反应重复3次。miR-141-3p及其靶基因的引物序列见表1。以U6小环RNA作为内参[6,8]，结果采用2-△△Ct相对定量法[17]计算。分别按miR-141-3p、PTEN、TGF-β2和p53的相对表达水平将结直肠癌患者划分为高值组和低值组，其中相对表达水平大于或等于平均值的患者归为高值组，相对表达水平小于平均值的患者归为低值组。

表1 用于RT-qPCR检测用的引物序列

2 结 果

2.1血浆miR-141-3p及其靶基因在手术前后的表达水平变化 在实施手术前，试验组血液中miR-141-3p的表达水平显著高于对照组，靶基因p53的表达水平也显著上升，而PTEN和TGF-β2的表达水平则显著低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。手术后，试验组miR-141-3p和p53的表达水平显著下调(P<0.05)，而PTEN和TGF-β2的表达水平显著上调(P<0.05)，见图1。

a：P<0.01，与对照组比较;b：P<0.05，与对照组比较

2.2血浆miR-141-3p及其靶基因的表达与结直肠癌临床病理特征的关系 血浆中miR-141-3p、PTEN、TGF-β2和p53的表达水平与结直肠癌患者的性别、年龄和肿瘤发生部位等无显著相关性(P>0.05)。miR-141-3p与肿瘤分化程度、浸润深度、TNM分期、淋巴结转移和远处转移有显著相关性(P<0.05)。PTEN和TGF-β2均与肿瘤分化程度、浸润深度和淋巴结转移有关(P<0.05)。p53与结直肠癌浸润深度、肿瘤大小和远处转移有关(P<0.05)，见表2。

表2 结直肠癌临床病理特征与miR-141-3p、PTEN、TGF-β2和p53的相对表达水平

表3 miR-141-3p及其靶基因的表达与复发率和生存率的关系

2.3高值组和低值组结直肠癌患者复发率和生存率比较 miR-141-3p低值组患者的复发率低于高值组(P<0.05)，生存率也优于高值组(P<0.05)。PTEN和TGF-β2高值组患者的复发率低于低值组(P<0.05)，生存率优于低值组。p53低值组患者的复发率低于高值组(P<0.05)，生存率优于高值组，见表3。

3 讨 论

研究miR与靶基因之间的相互调控关系，可以了解结直肠癌的发生机制，为诊断和治疗提供新的靶点[9,11]。目前，miR在结直肠癌研究方面已有较多的报道[18]，例如miR-21[19]、miR-106a[16]、miR-155[20]和miR-141-3p[8,10]等。但miR-141-3p在结直肠癌患者血浆中表达的报道较少，其靶基因及其与结直肠癌临床病理和治疗预后相关性的报道几乎没有。而在其他癌症报道中，miR-141-3p可能与PTEN、TGF-β2和p53等存在直接的相互作用[1,4,12]。

本研究结果显示，试验组结直肠癌患者手术前血浆中miR-141-3p的表达显著高于对照组，p53的表达与之类似，而PTEN和TGF-β2的表达显著低于对照组(P<0.01)。这与它们分别在胃癌和食管癌等癌症中的表达情况一致[7,21-23]。试验组结直肠癌患者手术后，再次检测其血浆中miR-141-3p、PTEN、TGF-β2和p53的表达水平，结果表明，术后miR-141-3p的表达水平比术前显著降低(P<0.01)，p53的表达与之类似，术后PTEN和TGF-β2的表达水平比术前显著升高(P<0.05)。这说明在结直肠癌患者血浆中，miR-141-3p与抑癌基因p53的表达规律基本一致，呈正相关，而与PTEN和TGF-β2的表达水平则呈负调控关系。这与之前在其他肿瘤组织中报道的结果基本一致[1,4,12]。这些结果说明miR-141-3p、PTEN、TGF-β2和p53可能参与了结直肠癌的发生、发展过程。

本研究进一步分析了miR-141-3p及其靶基因的表达水平与结直肠癌临床病理特征的关系。结果显示，miR-141-3p与多种临床病理特征有显著相关性，包括肿瘤分化、浸润、分期和转移等。PTEN和TGF-β2主要与肿瘤分化、浸润和淋巴结转移有关(P<0.05)。而p53则与结直肠癌浸润深度、肿瘤大小和远处转移有关(P<0.05)。按相对表达水平分组分析后发现，miR-141-3p和p53低表达组的术后复发率低，生存率高；PTEN和TGF-β2高表达组的术后复发率低，生存率高。以上分析表明，结直肠癌患者血浆中miR-141-3p及其靶基因具有作为生物标志物的潜力[18]，可能有助于结直肠癌的早期诊断、辅助治疗和评估预后。