外周血循环肿瘤细胞上皮-间质转化机制调控的EP方案治疗小细胞肺癌的研究∗

聂启鸿，刘华峰，卢燕军

(江西省赣州市人民医院肿瘤科 341000)

肺癌是世界范围内病死率较高的恶性肿瘤之一，而小细胞肺癌占肺癌发病率的20%～25%[1]，其为临床上常见的未分化恶性肿瘤，细胞倍增时间短、进展速度快[2]。小细胞肺癌患者早期表现为血行转移，对化疗较为敏感[3]。外周血循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)是恶性肿瘤复发和转移的关键因素，与患者的预后密切相关[4]。分析CTCs水平对评估恶性肿瘤的复发和药物疗效及指导临床合理用药具有重要的价值。美国国立综合癌症网络(NCCN)指南推荐的小细胞肺癌一线治疗方案为依托泊苷联合顺铂(EP)方案和伊立替康联合顺铂(IP)方案[5]。本研究分析外周血CTCs上皮-间质转化机制调控的EP方案治疗小细胞肺癌的效果，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取本院2015年5月至2017年5月EP方案治疗的100例小细胞肺癌患者(观察组)，其中男64例，女36例，年龄43～67岁，平均(55.1±9.8)岁。以本院同期IP方案治疗的100例小细胞肺癌患者为对照组，其中男63例，女37例，年龄42～68岁，平均(55.9±10.2)岁。纳入标准：(1)符合原卫生部《原发性肺癌诊疗规范》(2011年版)中非小细胞肺癌的诊断标准；(2)均经过病理学确诊为小细胞肺癌；(3)临床资料完整并同意本研究。排除标准：(1)并发其他恶性肿瘤；(2)临床资料不完整；(3)有严重的认知功能障碍；(4)有严重的心肾功能异常。本研究经医院伦理委员会批准，所有对象均知情同意。两组患者性别、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1治疗方法 对照组患者行IP方案：第1、8天静脉滴注伊立替康165 mg/m2和顺铂30 mg/m2。观察组患者行EP方案：第1～3天静脉滴注依托泊苷100～125 mg/m2和顺铂25 mg/m2。两组治疗21 d为1个周期，共治疗4个周期，治疗结束后评价疗效。

1.2.2外周血CTCs分离计数 采集患者清晨空腹静脉血5 mL，常温保存并富集肿瘤细胞。3 000 r/min离心15 min后弃去上清液，加入红细胞裂解液，温孵震荡后离心去除上层红细胞。再次离心去除上清液后将所得细胞液与Miltenyi免疫磁珠混合、孵育，并经过强磁场作用去除白细胞，富集上皮来源的稀有细胞，用免疫荧光染色技术鉴定CTCs并进行计数。

1.2.3疗效评价 本研究按照实体瘤疗效标准对两组研究对象的治疗效果进行评价，完全缓解(CR)：目标病灶消失，至少维持4周；部分缓解(PR)：基线病灶最大径之和降低30%，至少维持4周；稳定(SD)：基线病灶最大径之和减少但达不到30%；进展(PD)。客观缓解(CR+PR)认为有治疗效果。

1.2.4荧光定量PCR法 荧光定量PCR采用罗氏LightCycler480实时荧光定量PCR仪进行。扩增体系：2×qPCR Mix 5 μL，上下游引物各10 pmol，cDNA模板2 μL，超纯水1 μL，反应体系共10 μL。扩增反应条件：95 ℃，10 s；60 ℃，40 s，共30个循环。△Ct=待检基因Ct-内参基因Ct。

1.2.5酶联免疫吸附测定法 钙离子依赖的细胞黏附素家族(E-cadherin)检测试剂盒购自R&D公司，β-catenin 检测试剂盒购自Abcam公司，细胞角蛋白-19(CK-19)检测试剂盒购自ABclonal公司，波形蛋白(Vimentin)检测试剂盒购自Omega公司，所有检测过程均按照试剂盒说明书要求进行。

2 结 果

2.1两组治疗小细胞肺癌临床效果分析 观察组CR+PR比例为60.0%，明显高于对照组的46.0%，差异有统计学意义(χ2=3.546，P=0.007)，见表1。

表1 两方案治疗小细胞肺癌临床效果分析[n(%)]

2.2两组治疗后CTCs数目及表型变化分析 两组治疗后CTCs阳性表达例数及计数均明显降低，且对照组患者的上述指标降低更显著(P<0.05)，见表2。

表2 两组治疗后CTCs数目及表型变化分析

2.3两组治疗后E-cadherin及β-catenin mRNA变化分析 两组治疗后E-cadherin及β-catenin mRNA水平明显降低，且观察组患者的上述指标降低更显著(P<0.05)，见表3。

表3 两组治疗后E-cadherin及β-catenin mRNA变化分析

表4 两组治疗前后E-cadherin、β-catenin、CK-19及Vimentin蛋白表达变化分析

2.4两组治疗后E-cadherin、β-catenin、CK-19及Vimentin蛋白表达变化分析 两组治疗后E-cadherin、β-catenin、Vimentin蛋白水平明显降低而CK-19蛋白水平明显升高，且观察组患者的上述指标降低更显著(P<0.05)，见表4。

3 讨 论

肺癌是威胁人类健康和生存的自常见的恶性肿瘤，且随着环境条件的恶化，其发病率和病死率有逐年升高的趋势[6]。小细胞肺癌分化程度低、生长快，早期易于转移和侵犯血管，但对放疗和化疗较为敏感[7]。EP方案和IP方案是临床治疗小细胞肺癌的推荐方案，且已经证实其对小细胞肺癌的疗效。

上皮-间质转化是具有极性的上皮细胞在特定的病理或生理条件下转化为间充质细胞的过程。上皮-间质转化是恶性肿瘤迁移能力和侵袭能力的重要机制，参与了恶性肿瘤的发生、发展过程。上皮-间质转化的发生与一系列蛋白的表达有关，如E-cadherin和Vimentin等。已有的证据显示上皮-间质转化涉及的信号通路或细胞因子包括转化生长因子-β(TGF-β)、转录因子、雄激素受体及CTCs等。在分析上皮-间质转化调控蛋白在前列腺癌侵袭、转移中的作用及其临床预后诊断价值的研究中发现上皮-间质转化与肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移有关，E-cadherin有可能作为患者临床预后的诊断指标之一[8]。E-cadherin、Vimentin在不同病理分期宫颈癌中的表达存在差异性，即上皮-间质转化在宫颈癌的发生、发展过程中起到关键的作用[9]。Vimentin在口腔鳞状细胞癌(OSCC)组织中表达增强，而E-cadherin则表达降低，提示上皮-间质转化过程在OSCC发生及进展过程中发挥重要作用[10]，同时锌指转录因子Snail可能通过参与调控上皮-间质转化过程从而在乳腺癌的发生和侵袭过程中发挥重要作用，并推动乳腺癌的远处淋巴结转移[11]。本研究也发现EP方案和IP方案治疗后E-cadherin、Vimentin蛋白水平明显降低，且EP方案患者的上述指标降低更显著。β-catenin也是与肿瘤病理学过程密切相关的生物大分子，且与肿瘤的增殖及细胞凋亡过程密切相关[12-13]。在分析β-catenin和E-cadherin在食管鳞癌肿瘤芽殖中的表达时也证实食管鳞癌肿瘤芽殖中的β-catenin高表达和E-cadherin低表达与肿瘤浸润、转移关系密切[14]。以往的研究也证实β-catenin在胃肿瘤组织中表达水平显著升高，增殖细胞核抗原(PCNA)诊断胃肿瘤的价值高于β-catenin,但PCNA、β-catenin均可以作为胃肿瘤预后评估指标[15]。本研究也证实EP方案和IP方案治疗后CTCs阳性表达例数及计数均明显降低，β-catenin蛋白水平明显降低，且EP方案患者的上述指标降低更显著，表明EP治疗方案对小细胞肺癌有较好的效果，可能与其抑制上皮-间质转化分子β-catenin有关。

综上所述，EP治疗方案对小细胞肺癌有较好的效果，可能与其抑制上皮-间质转化有关。