牛磺酸薄荷复合运动饮料研制及其体外抗氧化活性

(郑州工商学院,河南郑州 451400)

人体在运动时,易产生疲劳状态,使得机体内氧化还原平衡被破坏,生成的过量自由基容易造成组织损伤,进而引发一系列疾病。运动饮料因具有较好的抗氧化作用,可为疲劳机体快速补充水分、电解质与能量,因此被大量研究[1-2]。牛磺酸作为非蛋白质氨基酸,具有促进营养物质代谢、提高机体生理功能与免疫的能力,特别是其在增强心肌收缩力,维持机体运动的同时,还可防止心肌受损、保护肝脏,因而在运动饮料成分中充当“主要角色”,并在食品添加剂中大量应用[3-4]。然而牛磺酸的使用成本逐年递增,如何在减少运动饮料中牛磺酸用量的同时，维持相同的抗氧化作用效果的相关研究具有重大意义。

薄荷,唇形科薄荷属草本植物,富含黄酮与迷迭香酸类化合物[5],She等[6]研究发现,水溶液分离出的酚酸类化合物具有较强的抗氧化活性,可以快速消除运动疲劳或损伤生成的氧自由基,抑制羟自由基诱导的脂质过氧化反应,保护生物膜结构与功能。本研究以牛磺酸与薄荷为原料,利用薄荷的药食两用特性与功效,减少牛磺酸在运动饮料的常规浓度,同时辅以白砂糖、黄原胶、羧甲基纤维素钠与结冷胶,研制牛磺酸薄荷复合运动饮料,通过检测其对羟自由基、超氧阴离子自由基与DPPH自由基的清除率,观察其抗氧化作用效果。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牛磺酸 潜江永安药业股份有限公司;新鲜薄荷叶、白砂糖 某农贸市场;羧甲基纤维素钠 武汉艾诺森生物科技有限公司;黄原胶 济南意和旺化工科技有限公司;结冷胶 湖南亿全生物科技有限公司;硫酸亚铁、无水乙醇、双氧水、磷酸氢钠、磷酸氢二钠 均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司;水杨酸、甲硫氨酸、核黄素 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氮盐四唑(NBT)、DPPH自由基 美国Sigma公司;HN功能饮料 市售;试验用水 超纯水。

TP-A200电子天平 长沙明杰仪器有限公司;UV-7504紫外可见分光光度计 上海精密仪器仪表有限公司;高压均质机 上海诺尼轻工机械有限公司;BW4T150Q灌装机 浙江博炜食品机械有限公司;FZG-20干热灭菌柜 南京煜鑫机械科技有限公司;KQ500DB超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;H1-16K离心机 湖南可成仪器设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 工艺流程 复合饮料工艺流程图[7]如图1所示。

图1 复合饮料工艺流程图Fig.1 The technological process of mixed sports beverage

1.2.2 工艺要点

1.2.2.1 薄荷液制备 定量称取薄荷叶,洗净后粉碎,加入一定体积的纯化水,在温度50 ℃,功率400 W条件下超声提取30 min后,以4000 r/min速率离心10 min,即得薄荷液[8]。

1.2.2.2 调配 薄荷液、牛磺酸、白砂糖以一定比例在水中混合成原料液后,加入复合稳定剂(黄原胶、羧甲基纤维素钠与结冷胶按一定配比制得的溶液),调配至成品。

1.2.2.3 均质、灌装与灭菌 成品料液均质搅拌2次后灌装,于121 ℃灭菌10 min,冷却后制得运动饮料[9]。

1.2.3 复合饮料配方优化

1.2.3.1 单因素试验设计 在薄荷液8%、白砂糖4%条件下,考察牛磺酸用量(0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%)对感官评价的影响;在牛磺酸0.03%、白砂糖4%条件下,考察薄荷液用量(2%、4%、6%、8%、10%)对感官评价的影响;在牛磺酸0.03%、薄荷液8%条件下,考察白砂糖用量(2%、3%、4%、5%、6%)对感官评价的影响。在上述单因素实验中,固定复合稳定剂添加量为黄原胶0.15%、羧甲基纤维素钠0.30%、结冷胶0.08%。

1.2.3.2 正交试验设计 在单因素实验基础上,以牛磺酸(A)、薄荷液(B)、白砂糖(C)用量为考察因素,进行三因素三水平的正交试验,具体因素水平见表1所示。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.3.3 感官评价 参考口服饮料感官评价标准[10],制定牛磺酸薄荷复合运动饮料感官评价标准,见表2所示,聘请具有饮料感官评价经验的10位食品工作者,分别按照色泽、气味、口感与组织形态四个维度,对不同配方参数制得的运动饮料进行评价,每个样品重复3次,取平均值。

表2 牛磺酸薄荷复合运动饮料感官评价标准Table 2 Sensory evaluation criteria of taurine and mint mixed sports beverage

2.4 复合稳定剂配比设计

1.2.4.1 单因素实验设计 在羧甲基纤维素钠0.30%、结冷胶0.08%条件下,考察黄原胶用量(0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%)对离心沉淀率的影响;在黄原胶0.15%、结冷胶0.08%条件下,考察羧甲基纤维素钠用量(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%)对离心沉淀率的影响;在黄原胶0.15%、羧甲基纤维素钠0.30%条件下,考察结冷胶用量(0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%)对离心沉淀率的影响。在上述单因素实验中,固定原料液配比为牛磺酸0.03%、薄荷液8%、白砂糖4%。

1.2.4.2 响应面优化设计 在单因素实验基础上,以黄原胶(A)、羧甲基纤维素钠(B)、结冷胶(C)用量为响应因素,离心沉淀率为响应值(Y),设计三因素三水平响应面试验,利用Design-Expert软件的Box-Behnken试验设计原理,优化复合稳定剂配比,试验因素水平见表3所示。

表3 响应面试验因素水平表Table 3 Factors and levels in response surface experiment

1.2.4.3 离心沉淀率测定 以离心沉淀率衡量运动饮料的稳定性,离心沉淀率越大,则溶液稳定性越差。称取复合饮料m0,置于离心管中,以3000 r/min,离心10 min后,对管内上清液称重，记为m,按照下式计算溶液的离心沉淀率,平行测定三次[11]。

式(1)

式中:w为溶液离心沉淀率,%;m0为复合饮料初始质量,g;m为离心后上清液质量,g。

1.2.5 贮藏稳定性研究 灌装灭菌后的产品分别置于37 ℃恒温培养箱和4 ℃冰箱存放6个月,观察有无明显沉淀与分层。

1.2.6 自由基清除率测定

1.2.6.1 羟自由基清除率 准确移取2 mL复合饮料于试管内,另加入2 mL硫酸亚铁(9 mmol/L)和2 mL水杨酸(9 mmol/L)摇匀,随后加入2 mL双氧水(20 mmol/L)混合摇匀后,于37 ℃水浴加热30 min,以纯化水作空白对照,于510 nm波长处测定吸光度,平行测定六次,按照下式计算清除率[12]。

式(2)

式中,A1为样品测定吸光度值;A2为以水替代双氧水溶液时样品的吸光度值;A0为以水替代样品时空白对照的吸光度值;w为羟自由基清除率,%。

1.2.6.2 超氧阴离子自由基清除率 准确移取1 mL复合饮料于试管内,依次加入0.5 mL磷酸缓冲盐溶液,1.5 mL 甲硫氨酸(0.026 mol/L),0.5 mL NBT(0.08 mol/L)和0.3 mL核黄素(0.02 mol/L),摇匀后,光照30 min,以纯化水作空白对照,于560 nm波长处测定吸光度,平行测定六次,按照公式2计算清除率[13]。

1.2.6.3 DPPH自由基清除率 准确移取2 mL复合饮料于试管内,加入2 mL DPPH自由基乙醇溶液(0.2 mol/L),摇匀后,避光30 min,以无水乙醇作空白对照,于517 nm波长处测定吸光度,平行测定六次,按照下式计算清除率[14]。

式(3)

式中,A1为样品测定吸光度值;A2为以水替代DPPH乙醇溶液时样品的吸光度值;A0为以水替代样品时空白对照的吸光度值;w为DPPH自由基清除率,%。

1.3 数据处理

复合饮料抗氧化性检测结果采用均数、标准差描述,利用SPSS 19.0进行方差分析,当P<0.05表示具有显著性差异,P<0.01表示具有极显著性差异。

2 结果与讨论

2.1 复合运动饮料原料液配比优化

2.1.1 单因素实验结果

2.1.1.1 牛磺酸用量影响 不同牛磺酸用量对运动饮料的感官评价影响见图2所示。从图2可知,当牛磺酸用量在0.03%时,感官评价得分最高为(83.7±0.9)分,此时溶液呈淡黄色,酸甜适中,而浓度较高时,溶液颜色加深,混浊感较明显,因此本研究选择牛磺酸用量0.02%、0.03%、0.04%作为正交试验考察水平。

图2 牛磺酸用量对复合运动饮料感官影响Fig.2 Effect of taurine addition on sensory score of mixed sports beverage

2.1.1.2 薄荷液用量影响 不同薄荷液用量对运动饮料的感官评价影响见图3所示。从图3可知,随着薄荷液用量增多,复合饮料感官评价结果先升高后降低,在8%时达到最高为(84.1±1.7)分。薄荷液浓度偏高时,溶液的清凉口感较重,掩盖了其它成份味道,因此本研究选择薄荷液用量7%、8%、9%作为正交试验考察水平。

图3 薄荷液用量对复合运动饮料感官影响Fig.3 Effect of mint liquid addition on sensory score of mixed sports beverage

2.1.1.3 白砂糖用量影响 运动饮料中添加白砂糖有利于调整口感,不同白砂糖用量对运动饮料的感官评价影响见图4所示。从图4可知,白砂糖用量4%时,感官评价得分最高为(84.3±0.8)分。当用量较低时,溶液甜味偏低,涩味较重,而用量较高时,饮料甜度偏大,影响自身风味[15-16],因此本研究选择白砂糖用量3%、4%、5%作为正交试验考察水平。

图4 白砂糖用量对复合运动饮料感官影响Fig.4 Effect of white sugar addition on sensory score of mixed sports beverage

2.1.2 正交试验 根据上述单因素实验结果可知,牛磺酸、薄荷液与白砂糖用量对饮料的感官评价影响较大,但考虑单因素实验结果并非最优值,因此设计以三者为变量的三因素三水平正交试验,确定饮料原料液的最佳配比,试验结果见表4所示。

从表4可知,RC>RB>RA,各因素对牛磺酸薄荷复合运动饮料的感官评价影响顺序为:白砂糖用量>薄荷液用量>牛磺酸用量,通过极差分析可知,饮料原料液最佳配比为A2B1C1,即牛磺酸用量0.03%,薄荷液用量6%,白砂糖用量3%。在该配比下,运动饮料的感官评分为(87.3±0.9)分,此时溶液的薄荷气味浓郁,色泽均匀、透亮,呈浅黄色,酸甜适中,具有清凉感,无明显沉淀与分层。

表4 正交试验结果Table 4 Results of the orthogonal test

2.2 复合稳定剂配比

2.2.1 单因素实验结果

2.2.1.1 黄原胶用量影响 薄荷叶在超声分离提取后,仍有部分纤维组织或大分子物质进入上清液,因此利用复合稳定剂提高溶液的稳定性。图5为黄原胶用量对溶液离心沉淀率的影响,从图5可知,随着黄原胶用量的增多,离心沉淀率不断减小,至0.15%后基本未变。这是因为黄原胶可吸附带正电荷的蛋白质大分子,形成空间位阻,从而减少蛋白质沉淀[17],因此本研究选择黄原胶用量0.10%、0.15%、0.20%作为响应面因素考察水平。

图5 黄原胶用量对离心沉淀率的影响Fig.5 Effect of xanthan gum content on centrifugation sedimentation rate

2.2.1.2 羧甲基纤维素钠用量影响 羧甲基纤维素钠与黄原胶复配具有较好协同增效效果,联合应用时可显著增加饮料的稳定性[18]。从图6可见,当用量为0.3%时,溶液沉淀离心率下降趋于稳定,因此本研究选择羧甲基纤维素钠用量0.2%、0.3%、0.4%作为响应面因素考察水平。

图6 羧甲基纤维素钠用量对离心沉淀率的影响Fig.6 Effect of carboxymethyl cellulose sodium content on centrifugation sedimentation rate

2.2.1.3 结冷胶用量影响 结冷胶可有效提高运动饮料的稳定性与悬浮能力[19-20],由图7可知,随着结冷胶用量增多,离心沉淀率逐渐下降,当用量增加至0.08%后,基本稳定,因此本研究选择结冷胶用量0.07%、0.08%、0.09%作为响应面因素考察水平。

图7 结冷胶用量对离心沉淀率的影响Fig.7 Effect of gellan gum content on centrifugation sedimentation rate

2.2.2 响应面优化

2.2.2.1 试验结果 根据上述单因素实验结果,以黄原胶、羧甲基纤维素钠及结冷胶用量为响应面考察因素,进行三因素三水平响应面Box-Behnken试验结果见表5所示。

表5 Box-Behnken试验结果Table 5 Results of the response surface experiment

上述试验结果进行多元回归拟合,得到以离心沉淀率为目标函数,各参数编码值的二次多项回归方程:Y=1.14+0.024A-0.053B-0.061C+0.025AB+0.048AC+0.075BC+0.11A2-1.25×10-3B2+0.12C2,对该模型进行方差分析,结果见表6所示。

从表6可知,该回归模型P<0. 01,表明该模型极显著,可较好反映实际结果,R2=0.9409显示该模型拟合值与实际结果具有高度相关性,而模型失拟项P=0.3383>0.05表示没有显著性差异。一次项B、交互项BC对离心沉淀率的影响显著(P<0.05);一次项C,二次项A2、C2对离心沉淀率的影响极显著(P<0.01)。从F值可知,各因素对离心沉淀率的影响程度顺序依次为:C(结冷胶用量)>B(羧甲基纤维素钠用量)>A(黄原胶用量)。

表6 响应面方差分析Table 6 Analysis of variance of response surface experiment

2.2.2.2 响应曲面分析 复合稳定剂中黄原胶、羧甲基纤维素钠与结冷胶的交互作用及对离心沉淀率的影响见图8所示。从图8可知,稳定剂添加有利于该饮料的离心沉淀率下降,但下降至一定值后趋于增大,结冷胶与羧甲基纤维素钠之间曲面坡度较大,等高线呈椭圆形，交互作用显著。

图8 不同稳定剂用量对离心沉淀率的响应曲面图Fig.8 Response surface map of different components amounts on centrifugal sedimentation rate

2.2.2.3 验证试验 采用响应面法分析,确定饮料中复合稳定剂最佳配比参数为:黄原胶0.14%、羧甲基纤维素钠0.40%、结冷胶0.08%,离心沉淀率最低预测值1.08%。在此条件下进行验证试验,测得饮料的实际沉淀率为1.05%±0.01%,与预测结果相近,饮料放置6个月后,见图9所示,无明显沉淀与分层。

图9 不同贮藏条件的样品稳定性比较Fig.9 Comparison of stability of samples in different storage conditions注:从左至右:0月样品、4 ℃样品、37 ℃样品。

2.3 抗氧化性

利用自由基清除剂的体外模型研究方法[21-22],通过考察牛磺酸薄荷复合运动饮料(牛磺酸:0.03%)和HN饮料(牛磺酸:0.05%)对羟基自由基、超氧阴离子自由基与DPPH自由基的清除能力,来比较各自的抗氧化活性,结果见表7所示。从表7可见,牛磺酸薄荷复合运动饮料对羟基自由基的清除能力显著低于HN饮料(P<0.05),而对其它两种氧自由基的清除率,牛磺酸薄荷复合运动饮料均极显著高于HN饮料(P<0.01),表明低于常规浓度的牛磺酸与薄荷组成的复合物有助于增强抗氧化活性。

表7 不同饮料对三种自由基清除率Table 7 The scavenging rates of different beverages against three kinds of oxygen radicals

3 结论

本研究以牛磺酸、薄荷为原料,辅以白砂糖、黄原胶、羧甲基纤维素钠与结冷胶研制复合运动饮料。通过单因素与正交试验确定饮料中原料液最佳配比参数为:牛磺酸0.03%、薄荷液6%、白砂糖3%、感官评价达到(87. 3±0.9)分;通过单因素与响应面分析试验确定饮料中复合稳定剂的最佳配比参数为:黄原胶0.14%、羧甲基纤维素钠0.40%、结冷胶0.08%,离心沉淀率为1.05%±0.01%。根据上述最佳配比参数制得的复合运动饮料的薄荷气味浓郁,色泽均匀、透亮,呈浅黄色,酸甜适中,具有清凉感,无明显沉淀与分层。该复合运动饮料在降低牛磺酸常规用量的同时,具有较好的抗氧化作用效果,对羟自由基、超氧阴离子自由基和DPPH自由基的清除率分别为42.76%、65.25%和57.46%,因而具有较好的推广前景。