不同品种甘薯叶提取物抗氧化及对α葡萄糖苷酶抑制活性的研究

(聊城大学农学院,山东聊城 252000)

糖尿病是一种以高血糖和血管并发症为特征的全球性代谢紊乱疾病。糖尿病已经成为60岁以下人群死亡的主要原因,占全球死亡总数的9%[1]。Ⅱ型(非胰岛素依赖型)糖尿病的死亡主要是由于脑血管、心血管、下肢动脉疾病等大血管并发症导致的,其基本病理改变为动脉粥样硬化[2]。通过使用α-葡萄糖苷酶抑制剂抑制碳水化合物消化来降低餐后高血糖是一种非常有效的糖尿病治疗方法。α-葡萄糖苷酶是位于肠细胞刷状表面膜的一种糖酶,催化低聚糖水解成单糖,促进小肠对葡萄糖的吸收[3]。有效的α-葡萄糖苷酶抑制剂可以显著延缓体内的葡萄糖吸收,降低血糖水平[4]。多项研究表明,糖尿病人血液中的高血糖水平容易引起葡萄糖自氧化和蛋白糖基化,从而导致自由基过度生成,细胞氧化还原平衡被打破,引起氧化应激反应[5-6]。氧化应激会损害糖尿病患者胰岛素的分泌和胰岛素的作用,并且会促进动脉粥样硬化的形成,引起糖尿病并发症[7]。因此,氧化应激是糖尿病及其并发症发生发展的关键因素。通过单纯降糖治疗并不能有效降低并发症的风险,临床上通常使用抗血小板凝集(如阿司匹林)和稳定斑块(如他汀类)的药物进行干预治疗[8]。然而,利用降血糖、抗血小板聚集、稳定斑块的药物治疗糖尿病方法都有其局限性,如阿卡波糖会引起胃肠副反应;胃溃疡患者不能服用阿司匹林;他汀类药物可能会对肝脏造成损害等[9-11]。因此,有必要探索并找到一些有效且安全的α-葡萄糖苷酶抑制剂和抗氧化剂来补充或替代药物以达到预防和治疗Ⅱ型糖尿病及其并发症的疗效。

研究表明,膳食中多酚的摄入能够通过抗氧化作用抵御高血糖引起的氧化应激和抑制α-葡萄糖苷酶活性影响碳水化合物代谢,从而影响糖尿病及其并发症的发生发展[12-13]。甘薯(IpomoeabatatasL.)是世界上最主要的粮食作物之一,中国是其最大的生产国。甘薯叶是甘薯作物的副产品,在世界上许多地区已被作为一种绿叶蔬菜食用,在预防炎症、肿瘤、癌症、心血管疾病、高血压、高血糖和糖尿病等多种疾病方面具有一定的作用,引起了普遍关注[14-16]。据报道,甘薯叶比许多其他常见的蔬菜具有更高的多酚含量和更强的抗氧化活性[17-18]。然而,在中国甘薯叶资源开发利用程度较低,除了少部分用作蔬菜和饲料外,绝大部分被废弃掉,造成资源的极大浪费。因此,为了开发出质量可靠、功效可靠的甘薯叶类营养保健品,研究验证甘薯叶活性成分及其生理功能具有非常重要的意义。然而,到目前为止,关于甘薯叶抗氧化活性,尤其是对抗糖尿病作用的研究报道还是比较有限。因此,本试验通过比较7种优质品种甘薯叶提取物中总多酚(总黄酮)含量、DPPH·清除能力、ABTS+·清除能力、·OH清除能力、还原能力以及对α-葡萄糖苷酶抑制能力来探讨甘薯叶抗氧化和降血糖的功效,为甘薯资源的开发与利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

7个甘薯品种(苏薯8、龙薯9、济薯18、商薯19、徐薯18、广薯87、烟薯25)幼苗 国家甘薯种质徐州试管苗库,经聊城大学农学院植物科学教研室进行鉴定,于2018年5月种植在聊城大学试验田中,10月进行甘薯叶采摘；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、2′-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS)、没食子酸(Gallic acid,GA)、芦丁、α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20) 色谱纯,sigma公司;4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-nitrophenylβ-D-glucopyranoside,PNPG)、阿卡波糖、维生素 C(Vitamin C,VC) 色谱纯,阿拉丁试剂公司;其他试剂 均为国产分析纯。

L5S型紫外可见分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司;UPW-20N型超纯水机 北京历元电子仪器有限公司;Fluosear荧光酶标仪 德国BMGLABTECH公司。

1.2 实验方法

1.2.1 甘薯叶提取物制备 新鲜甘薯叶晾干后,用粉碎机粉碎并过60目筛,将制得的甘薯叶粉末装入密封袋中,-20 ℃冷藏备用。本试验用蒸馏水、60%乙醇和无水乙醇做提取溶剂。精密称取2.00 g甘薯叶粉末,按1∶30 (m/V)加入提取溶剂,在超声功率100 W、温度50 ℃条件下,提取30 min,抽滤。残渣用相同的条件再次提取,合并两次滤液,旋转蒸发去除乙醇,并用蒸馏水定容于50 mL容量瓶中,得到甘薯叶提取物,4 ℃冷藏备用。

1.2.2 总多酚和总黄酮含量测定 总多酚含量采用福林酚法[19]:取样品各1.0 mL,于10 mL棕色容量瓶中,加入5.0 mL 10%福林酚试剂,混匀。反应3～8 min,加入4.0 mL 7.5% Na2CO3,加蒸馏水定容至10 mL,摇匀。室温下放置60 min,765 nm测定吸光度。以(0.1～0.6 mg/mL)没食子酸为标准品,绘制标准曲线Y=7.336X+0.151(R2=0.9991)。总多酚含量以没食子酸当量(mg GAE/g DW)表示。

总黄酮含量采用硝酸铝显色法[14]:取1 mL样品溶液于10 mL容量瓶中,各加5%亚硝酸钠溶液0.3 mL,摇匀,静止放置6 min,加10%硝酸铝溶液0.3 mL,混合均匀,静止放置6 min,加入1 mol/L氢氧化钠溶液4 mL,再用70%乙醇溶液稀释至刻度线,静止放置15 min后,分别在510 nm处测定其吸光度。以(0.01～0.06 mg/mL)芦丁为标准品,绘制标准曲线Y=11.464 X+0.0141(R2=0.9994)。总黄酮含量以芦丁当量(mg RE/g DW)表示。

1.2.3 DPPH·清除能力测定 取样品0.2 mL及3.8 mL 0.025 mmo1/L的DPPH溶液加入试管中,摇匀后放置30 min,测定517 nm处的吸光度A1。同时测定无水乙醇代替DPPH时的吸光度A2,用蒸馏水代替样品时的吸光度A0。由公式1计算DPPH·的抑制率。

式(1)

采用VC作阳性对照,甘薯叶清除DPPH·能力以VC当量(mg VCE/g DW)表示。

我国农业已经开始向信息化发展，但在万州区的农村地区，信息管理系统仍不完善，服务质量低，阻碍了农业现代化发展。农业市场信息传播不及时、农民思想观念落后、缺乏专业的培训教育等，使得农业信息化发展缓慢。先进的生产技术不能被高效利用和不能及时了解市场信息作出正确决策，导致了我国农业生产率和生产效益低下。

1.2.4 ABTS自由基清除能力测定 先将0.89 mL 140 mmol/L的过硫酸钾溶液加入到50 mL 7 mmol/L ABTS溶液中,过夜,4 ℃下保存,制备成为ABTS储备液。临用前将ABTS储备液进行稀释,在734 nm下使其吸光值在0.70±0.02,制成ABTS工作液。将0.1 mL样品加入到1.9 mL的ABTS工作液中,充分混匀,避光反应6 min后在734 nm下测定吸光值A1,同时测定蒸馏水代替ABTS时的吸光度A2,用蒸馏水代替样品时的吸光度A0。由式(1)计算ABTS自由基的抑制率。VC作阳性对照,甘薯叶清除ABTS自由基能力以VC当量(mg VCE/g DW)表示。

1.2.5 羟自由基(·OH)清除能力测定 反应体系由 0.5 mL的8 mmol/L FeSO4,0.8 mL的6 mmol/L H2O2,0.5 mL蒸馏水,1 mL不同浓度的试样及0.2 mL的20 mmol/L水杨酸钠组成。反应体系在37 ℃下反应1 h,562 nm下测定吸光值A1,同时测定蒸馏水代替水杨酸时的吸光度A2,用蒸馏水代替样品时的吸光度A0。由式(1)计算OH·的抑制率。VC作阳性对照,甘薯叶清除OH·能力以VC当量(mg VCE/g DW)表示。

1.2.6 还原能力测定 取1 mL样品于试管中,依次加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS,pH6.6)和2.5 mL 1%铁氰化钾溶液,混匀后于50 ℃水浴保温20 min后,快速冷却,再加入2.5 mL 10%三氯乙酸,5000 r/min离心10 min,取上清液2.5 mL,依次加入2.5 mL蒸馏水、0.5 mL 0.1%三氯化铁,充分混匀,在700 nm下测其吸光度,试样还原能力以吸光值表示。VC作阳性对照,甘薯叶的还原能力以VC当量(mg VCE/g DW)表示。

1.2.7α-葡萄糖苷酶抑制能力测定 96孔板中加入磷酸钾缓冲液(pH6.8)100 μL、20%二甲基亚砜溶解的样品20 μL、2.5 mmol/L PNPG 20 μL,37 ℃恒温孵育15 min后加入0.2 U/mLα-葡萄糖苷酶20 μL,37 ℃恒温反应15 min。再加入80 μL浓度为0.2 mol/L的Na2CO3溶液,于405 nm波长处测定吸光度值A1。蒸馏水代替α-葡萄糖苷酶时的吸光度A2,用蒸馏水代替样品时的吸光度A0。由式(1)计算α-葡萄糖苷酶抑制率。阿卡波糖作阳性对照。

1.3 数据处理

所有试验均重复3次,结果表示为平均值±标准差。利用Minitab 17.0软件进行单因素方差分析,利用Pearson进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 不同品种甘薯叶总多酚和总黄酮含量分析

总多酚含量测定采用福林酚法,其结果以没食子酸当量表示(表1、表2)。3种不同极性提取溶剂对总多酚和总黄酮含量影响的结果表明(表1、表2),乙醇提取物显著高于水提取物(P<0.05),其含量高低依次为60%乙醇提取物>100%乙醇提取物>水提取物。在一些甘薯品种(苏薯8、广薯87和烟薯25)中60%乙醇提取物和100%乙醇提取物中总多酚和总黄酮含量在统计学上无明显差异(P>0.05)。Metrouh-Amir等指出,所用溶剂的极性以及被测材料中的化学成分对提取物的得率有很大影响[19]。不同品种甘薯叶提取物的总多酚和总黄酮含量具有相同的趋势,说明甘薯叶中多酚和黄酮的极性更接近60%乙醇,这与田燕楠等研究结果一致[20]。3种溶剂对比,水提取物中总多酚和总黄酮的含量最低,这可能与提取材料中蛋白质和碳水化合物等其他组分溶解度的增加有关。Do等也观察到类似的趋势,乙醇水溶液的水比例增加降低了紫苏黄酮的提取效率[21]。从提取得率、溶剂残留和经济性角度综合分析,60%乙醇可作为甘薯叶总多酚和总黄酮的最佳提取溶剂。

表1 7个品种甘薯叶不同溶剂提取物的总多酚含量Table 1 Total polyphenols contents of leaves extracts of different solvents from seven kinds of sweet potato

表2 7个品种甘薯叶不同溶剂提取物的总黄酮含量Table 2 Total flavonoids contents of leaves extracts of different solvents from seven kinds of sweet potato

7个甘薯品种60%乙醇提取物总多酚含量介于15.02～33.33 mg GAE/g DW,其含量高低依次为徐薯18>济薯18>龙薯9>商薯19>广薯87>烟薯25>苏薯8,其中含量最高的3个品种为徐薯18、济薯18和龙薯9,且无统计学差异(P>0.05)。7种甘薯品种60%乙醇提取物总黄酮变化趋势与总多酚相似,含量介于1.06～3.11 mg RE/g DW,其含量高低依次为济薯18>龙薯9>徐薯18>商薯19>广薯87>烟薯25>苏薯15,其中含量最高的3个品种为龙薯9、济薯18和徐薯18,且无统计学差异(P>0.05)。结果提示龙薯9、济薯18和徐薯18 3个品种甘薯叶是多酚的潜在优势来源。

2.2 抗氧化活性

图1 不同品种甘薯叶提取物抗氧化活性对比Fig.1 Antioxidant activity of leaves extract of different kinds of sweet potato注:(A)DPPH·清除能力;(B)ABTS+·清除能力;(C)·OH清除能力;(D)还原能力。不同字母表示差异显著,P<0.05;图2同。

2.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性

采用体外酶活测定进一步评价7种甘薯叶提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性(图2)。α-葡萄糖苷酶抑制活性存在剂量依赖关系,未稀释的样品对α-葡萄糖苷酶抑制率介于31.08%～52.83%。7个甘薯品种α-葡萄糖苷酶抑制活性高低依次为商薯19>龙薯9>济薯18>徐薯18>广薯87>烟薯25>苏薯8。与阳性对照阿卡波糖对比,商薯19抑制α-葡萄糖苷酶活性相当于3.39 mg/mL阿卡波糖,而苏薯8相当于1.86 mg/mL阿卡波糖。

图2 不同品种甘薯叶提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制能力对比Fig.2 α-glucosidase inhibitory activity of leaves extract of different kinds of sweet potato

2.4 相关性分析

不同品种甘薯叶提取物抗氧化活性、α-葡萄糖苷酶抑制活性与其总多酚、总黄酮含量的相关性分析结果见表3。甘薯叶提取物总多酚和总黄酮含量与抗氧化活性(DPPH·清除能力、ABTS+·清除能力、·OH清除能力和还原能力)均呈极显著正相关性(P<0.01),但与α-葡萄糖苷酶抑制活性无显著相关性(P>0.05)。结果提示多酚(黄酮)是甘薯叶片中重要的抗氧化剂,其含量的高低可以直接反映抗氧化活性的强弱。而α-葡萄糖苷酶抑制活性不仅取决于多酚(黄酮)含量,也可能与其他活性成分(如多糖或有机酸)有关[22]。研究表明多酚(黄酮)结构中的邻位酚羟基很容易被氧化成醌类结构,使其具有较强清除自由基的能力和抗氧化活性,并且抗氧化活性强弱与其含量的高低、种类、结构、酚羟基数量和位置有关[1,14]。

表3 甘薯叶活性成分(总多酚和总黄酮)与抗氧化、α-葡萄糖苷酶的抑制活性的相关性Table 3 The relationships of the contents of total polyphenols and total flavonoids with the antioxidant activity and α-glucosidase inhibitory activity of sweet potato leaves

3 讨论

本研究显示,7个品种甘薯叶均含有丰富的多酚和相对较低黄酮类物质,总多酚含量介于15.02～33.33 mg GAE/g DW,总黄酮含量介于1.06～3.11 mg RE/g DW。这与Fu等对甘薯叶多酚和黄酮的研究结果一致,其结果显示甘薯叶总多酚含量介于23.3～43.8 mg CAE/g DW,总黄酮含量介于0.6～3.4 mg QE/g DW[23]。多酚是植物中一类重要的次生代谢产物,是决定水果、蔬菜等植物感官和营养品质的重要因素,由于具有较高的抗氧化能力,随饮食摄入后有益于身体健康[24]。Pérez-Jiménez等对24种常见的食用蔬菜和水果(苹果、香蕉、橘子、梨、桃、葡萄、柑橘、西瓜、甜瓜、土豆、胡萝卜、生菜、四季豆、菊苣、西葫芦、洋葱、甘蓝、西蓝花、青椒、芦笋、甜菜、红菜根和菠菜)中抗氧化剂的含量和结构进行研究,报道显示24种蔬菜和水果中总多酚含量的平均值为(591.5±320.1) mg/100 g干重[24]。通过与该研究结果对比,发现甘薯叶中总多酚的含量高于普通的蔬菜和水果,甚至高于含量最高的蔬菜类青椒(1834.4±186.9 mg/100 g 干重)和含量最高的水果类葡萄(1870.0±192.0 mg/100 g干重)。这与Sun等人的研究结果相一致,Sun指出甘薯叶中多酚含量是一些普通蔬菜(如菠菜、甘蓝)的2～3倍,因此无论甘薯叶作为蔬菜食用或作为多酚物质来源都具有较强的优势[25]。一些研究表明,不同品种植物中多酚含量具有差异,可能与多酚氧化酶活性、成熟度、采后加工方式、基因型、贮藏条件和营养成分等因素有关[25-27]。本研究所选的甘薯品种统一进行种植和采收,并采用相同的采后加工方式和贮藏条件,因此甘薯叶多酚含量存在差异可能主要受基因型(遗传因素)的影响。

多酚是天然植物提取物中具有抗氧化活性的主要物质基础,而黄酮主要是植物为抵抗环境胁迫产生的一类多酚类化合物[28-29]。本研究结果显示甘薯叶提取物均具有良好的抗氧化活性,且与总多酚和总黄酮含量相关性显著。席利莎等对甘薯茎叶多酚的体外抗氧化活性与加工稳定性研究中表示,甘薯茎叶多酚具有良好的抗氧化活性,其DPPH·清除能力、·OH清除能力、还原能力、超氧阴离子清除能力和氧自由基吸收能力都高于茶多酚和葡萄籽多酚[30]。一些研究表明,甘薯叶多酚主要以酚酸和黄酮为主,其中酚酸类成分主要包括咖啡酸、绿原酸、反式-咖啡酸、3,4-二-反式-咖啡酞奎尼酸、4,5-二-反式-咖啡酞奎尼酸、3,5-二-反式-咖啡酸奎尼酸和3,4,5-三-反式-咖啡酞奎尼酸;黄酮类成分主要包括槲皮素、槲皮素甙(槲皮素-3-O-葡萄糖苷)、4,7-二甲氧基山奈酚和3,4,7-三甲氧基槲皮素[1,14,31-33]。酚羟基是多酚类物质起抗氧化功能的主要官能基团。Zhang等和Islam等也指出多酚是甘薯叶中主要的抗氧化剂,且多酚结构与抗氧化活性密切相关,酚羟基数量越多,奎尼酸咖啡酰化程度越高,黄酮甲氧化程度越低,抗氧化活性越强[1,14,31]。甘薯叶多酚可以提供氢原子稳定DPPH·和ABTS+·、捐赠电子减少Fe3+还原和螯合Fe2+抑制·OH的生成。本试验7个品种甘薯样品的DPPH·清除能力、ABTS+·清除能力和还原能力3个指标基本具有相同的变化趋势,但OH·清除能力的变化趋势有所差异,这可能是由于这四种抗氧化活性测定方法所依赖的机理不同造成的。前三个抗氧化指标关系到抗氧化剂提供氢原子和电子能力,而·OH清除能力依赖于抗氧化剂螯合金属离子的能力[34]。Fu等对不同溶剂甘薯叶提取物的抗氧化活性进行研究时和Singh等对木蓝提取物的抗氧化活性进行研究时也发现了类似的结果[23,35]。

α-葡萄糖苷酶抑制剂可以竞争性抑制α-葡萄糖苷酶的活性,从而减缓淀粉和蔗糖等向葡萄糖的转化,延缓肠道碳水化合物的吸收,进而达到降低血糖的目的[36]。研究发现天然产物多酚、多肽、多糖和萜类化合物都具有明显的α-葡萄糖苷酶抑制活性,其中一些物质甚至优于标准的α-葡萄糖苷酶抑制剂阿卡波糖[4]。本实验发现,甘薯叶提取物可以显著抑制α-葡萄糖苷酶活性,但与多酚和黄酮含量无显著相关性(P>0.05)。表明甘薯叶提取物对α-葡萄糖苷酶抑制活性不仅取决于多酚和黄酮含量,也可能与其他活性成分(如多糖或有机酸)有关。张彧等研究发现甘薯蔓黄酮和多糖对α-葡萄糖苷酶均具有抑制活性,且黄酮的抑制能力比多糖强[37]。高荫榆等在动物实验模型中发现甘薯叶黄酮对四氧嘧啶致糖尿病小鼠具有明显的降血糖作用,说明抑制α-葡萄糖苷酶活性并不是甘薯叶降血糖作用的唯一原因,还有可能与促进肝糖原的合成,改善糖尿病的脂质代谢及胰岛β细胞的分泌功能等影响因素有关[38]。

4 结论

本试验对7个优质品种的甘薯叶进行多酚类物质含量和生理活性进行研究,旨在开发以多酚类化合物为主要活性成分的非食品类保健品,特别是针对糖尿病患者的保健品。结果表明,不同品种的甘薯叶均具有较强的抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性,只是各评价指标检测结果存在一定差异。徐薯18、济薯18和龙薯9甘薯叶总多酚和总黄酮含量最高;龙薯9自由基(DPPH·、ABTS+·、·OH)清除能力最强;济薯18还原能力最强;商薯19抑制α-葡萄糖苷酶活性最强。由此可知,龙薯9和济薯18两个品种甘薯叶具有较高的多酚含量和抗氧化活性,可作为优质抗氧化剂的资源;而商薯19甘薯叶可以作为潜在降血糖的原料。本研究结果对甘薯种植和生产中的品种选择,特别是在食品药品工业中的潜在应用具有一定的参考价值。然而,甘薯叶提取物在动物模型中的抗氧化能力、安全性评价和毒理学研究还有待进一步深入。