紫锥菊提取物对环磷酰胺免疫抑制小鼠免疫功能影响研究

宋红卫，张惠喜，朱丽君，魏戎蓉，姜祎頔，郭灵玲

（1.菏泽市食品药品检验检测研究院，山东 菏泽 274000；2.菏泽信息工程学校，山东 菏泽 274000）

长期以来，中小规模养殖场的生产设施相对落后及缺乏畜禽养殖专业知识，养殖场为了预防生产中动物疾病的发生，长期和大量的使用动物保健药物，造成畜禽机体处于应激状态甚至免疫抑制情况的发生。因此，科研人员研发了各种免疫调节剂，以应对生产中出现的这些问题。随着农产品中残留化合物监管的日益广泛和严格，天然的植物药物成为理想的选择。紫锥菊（Echinacea）是原产于美洲的一类菊科野生花卉，作为免疫调节剂在国际上受到普遍重视，在美洲作为免疫促进剂和调节剂用于流行感冒的治疗[1]。对免疫力低下的生理状态有比较理想的免疫作用效果。本试验通过研究紫锥菊提取物对环磷酰胺免疫抑制小鼠免疫调节作用，为开发新型、安全、低毒的畜禽免疫调节剂奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物

SPF级昆明小鼠150只，雄性，体重18～22 g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司。

1.1.2 药材与试剂

紫锥菊提取物，HPLC检查，指纹图谱与紫锥菊提取物对照品图谱吻合。含量测定：菊苣酸≥2.0%，多酚≥4.0%。印度墨汁、RPMI1640细胞培养液、Hank's平衡盐溶液、胎牛血清、刀豆蛋白A（ConA）、MTT、补体（豚鼠血清）、SA缓冲液、都氏试剂，绵羊红细胞（SRBC）。

1.1.3 仪器设备

二氧化碳培养箱（德国BINDER，C170）；紫外可见分光光度计（日本岛津公司，UV-2700）；高压蒸汽灭菌器（济南德强仪器有限公司，MJ-3780D）；酶标仪（瑞士Tecan，Infinite 200 Pro）；离心机（sigma公司，3K15）；显微镜（日本Olympus，CX31）；恒温水浴锅（上海科恒实业发展有限公司）；电子天平（UX820S，日本岛津公司；XS-105，梅特勒公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 动物造模、分组及给药

试验小鼠50只，分为正常对照组、免疫抑制对照组、紫锥菊提取物高、中、低剂量组，每组3个重复，每个重复10只。除正常对照组外，各组小鼠腹腔注射环磷酰胺（100 mg·kg-1BW），1次·d-1，连续3 d，建立免疫抑制模型小鼠[2]。建模后高、中、低剂量组分别按240、120、60 mg·kg-1BW水平添加紫锥菊提取物，正常对照组、免疫抑制对照组给予等量的纯化水，以20 mL·kg-1BW灌胃体积，1次·d-1，连续30 d后测定各项免疫指标。分别进行免疫器官指数及碳廓清试验、血清溶血素值的测定、脾淋巴细胞增殖转化实验。

1.2.2 碳廓清试验及免疫器官指数测定

印度墨汁原液用生理盐水稀释4倍，各组小鼠尾静脉注射10 mL·kg-1BW，注射墨汁后2、10 min，分别从内眦静脉丛取血20 μL，立即加入2 mL 0.1%Na2CO3溶液中。以0.1%Na2CO3溶液作溶剂对照，600 nm波长处测定各试验组光密度值（OD）。采血结束，称重后颈椎脱臼处死小鼠，取出胸腺、肝脏和脾脏，去掉筋膜，用滤纸吸干脏器表面血污，分别称重，计算吞噬指数（a），同时计算胸腺/体重比值与脾脏/体重比值。

1.2.3 半数血清溶血素值（HC50）测定

每只小鼠腹腔注射2%（V/V）SRBC 0.2 mL，致敏后5 d，摘除眼球取血，2 000 r·min-1离心10 min，收集血清。将血清用SA缓冲液稀释200倍，测定半数溶血值（HC50）。

1.2.4 ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖转化实验

无菌取脾，置于盛有Hank's液平皿中，用镊子将脾磨碎，经过200目筛网过滤，用Hank's液洗2次，1 000 r·min-1离心10 min。将细胞悬浮于1640完全培养液中，调整细胞密度为3×106个·mL-1。将每1份脾细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1 mL，1孔加入ConA液75 μL，另1孔作为对照，置于5%CO2、37℃培养箱中培养72 h，培养结束前4 h，每孔轻轻吸取上清液0.7 mL，加入0.7 mL不含胎牛血清的RPMI1640培养液，同时加入5.0 mg·mL-1的MTT溶液50 μL，继续培养4 h。培养结束后，每孔加入1 mL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解，然后分装到96孔培养板中，每孔作3个平行孔，570 nm波长测定光密度值（OD值）。

2 试验结果

2.1 紫锥菊提取物对小鼠碳廓清能力的影响

紫锥菊提取物对小鼠碳廓清能力的影响见表1。

表1 紫锥菊提取物对小鼠碳廓清能力的影响

由表1可见，免疫抑制对照组的碳廓清能力显著低于正常对照组（P＜0.05）。给予环磷酰胺免疫抑制模型小鼠不同剂量紫锥菊提取物30 d后，各剂量组均能恢复免疫抑制小鼠下降的碳廓清能力，低剂量组恢复能力与免疫抑制组比较差异不大（P＞0.05），中、高剂量组恢复能力与免疫抑制组比较有显著性增高（P＜0.05），而且中剂量组能够恢复到正常的水平。

2.2 紫锥菊提取物对小鼠免疫器官指数的影响

紫锥菊提取物对免疫器官指数结果的影响见表2。

表2 对免疫器官指数结果的影响mg·g-1

由表2可见，免疫抑制对照组的胸腺和脾脏指数显著低于正常对照组（P＜0.05）。给予环磷酰胺免疫抑制模型小鼠不同剂量紫锥菊提取物30 d后，低，中、高各剂量组均能显著提高免疫抑制小鼠的胸腺和脾脏指数（P＜0.05，P＜0.01）。

2.3 紫锥菊提取物对小鼠血清溶血素值的影响

紫锥菊提取物对小鼠血清溶血素值的影响见表3。

表3 对小鼠血清溶血素值的影响

由表3可见，免疫抑制对照组的血清溶血素值显著低于正常对照组（P＜0.05）。给予环磷酰胺免疫抑制模型小鼠不同剂量紫锥菊提取物30 d后，低剂量组血清溶血素值与免疫抑制组比较差异不显著（P＞0.05），中、高剂量组血清溶血素值与免疫抑制组相比较显著提高（P＜0.05）。

2.4 紫锥菊提取物对ConA诱导小鼠脾淋巴细胞增殖转化结果的影响

紫锥菊提取物对对ConA诱导小鼠脾淋巴细胞转化结果的影响见表4。

表4 对ConA诱导小鼠脾淋巴细胞转化结果的影响

由表4可见，免疫抑制对照组的脾淋巴细胞转化结果显著低于正常对照组（P＜0.05）。给予环磷酰胺免疫抑制模型小鼠不同剂量紫锥菊提取物30 d后，低、中剂量组脾淋巴细胞转化结果与免疫抑制组比较差异不显著（P＞0.05），高剂量组脾淋巴细胞转化结果与免疫抑制组相比显著提高（P＜0.05）。

3 讨论

紫锥菊别名紫松果菊，花托为圆锥形，因其头状花序形似松果而得名，其主要功能成分为多糖、烷基酰胺类化合物和咖啡酸类衍生物[2]。吴江涛等研究显示，紫锥菊提取物可以增强氢化可的松免疫抑制小鼠的单核巨噬细胞吞噬功能[3]。王树琴等研究表明，紫锥菊提取物对肉鸡体液免疫和细胞免疫均具有促进作用[4]。巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，其吞噬能力是衡量机体非特异性免疫功能的标志之一，小鼠碳廓清试验中所测得的吞噬指数可反映单核-巨噬细胞的吞噬能力[5-6]。本试验结果表明，各剂量组均能恢复免疫抑制小鼠下降的碳廓清能力，中、高剂量组恢复水平与免疫抑制组比较显著提高（P＜0.05），而且中剂量组能够恢复到正常的水平，其原因可能与中草药免疫调节作用的双向性有关。

免疫器官按其功能可分为中枢免疫器官和外周免疫器官，胸腺和脾脏是机体重要的免疫器官，其脏器系数在一定程度上可以反映机体的免疫功能[8]。本试验结果表明，紫锥菊提取物低，中、高各剂量组均能显著提高免疫抑制小鼠的胸腺和脾脏指数。血清溶血素试验和脾淋巴细胞转化试验是评价机体体液免疫和细胞免疫功能的经典试验，试验结果表明，中、高剂量组血清溶血素值与免疫抑制组比较有显著性提高，高剂量组脾淋巴细胞转化结果与免疫抑制组比较有显著性提高。表明紫锥菊提取物可增强免疫抑制小鼠的体液和细胞免疫水平，其免疫调节作用可能与紫锥菊提取物能够增强淋巴细胞功能，刺激细胞因子和抗体的产生有密切关系，其相应的复杂药理机制还需进一步研究[7]。

4 结论

紫锥菊提取物具有调节环磷酰胺免疫抑制小鼠非特异性和特异性免疫的作用，是一种效果极好的免疫调节剂，如果能够在生产中合理使用，可以很好地增加疾病的预防效果。