高效捕获阪崎肠杆菌免疫磁珠的制备研究

姚骅珊，朱志强

（苏州健雄职业技术学院医药科技学院，江苏太仓215411）

阪崎肠杆菌（Enterobactor sakazakii E.sakazakii）属肠杆菌科，是一种棒状革兰氏阴性食源性致病菌[1]，被FAO/WHO认定为A类危害微生物，可引起婴幼儿脑膜炎、败血症和致死性小肠结肠炎等疾病，特别是早产儿及免疫力低下人群[2]，死亡率高达20%～50%，即使使用抗生素治疗康复，也会伴随着严重的神经系统后遗症和发育障碍等症状[3]。研究发现，阪崎肠杆菌具有较高的耐热性和极强的耐干燥特性[4]，奶粉是该菌的主要感染渠道[5]。婴儿配方粉质食品中微量的阪崎肠杆菌污染（＜3 CFU/100 g）也能导致感染发生[6]。为防止和控制奶粉制品中阪崎肠杆菌的污染和传播，建立一种高效且灵敏的检测阪崎肠杆菌的方法十分必要。目前较为常用的阪崎肠杆菌检测方法是FDA认可的经典检测程序——婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的分离与计数[7]，该法包括增菌、显色培养、生理生化鉴定三步，检测对样品需求量大，步骤繁琐，耗时长，大约需要5～7天才能获得检测结果，且准确度和特异性不高。近年来，利用免疫磁珠和定量PCR相结合检测食品中致病菌的方法相继被报道[8-10]，本研究在传统免疫磁珠制备的基础上，引入亲和力更高的链霉亲和素——生物素系统，提升磁珠与抗体偶联量，并优化捕获体系，建立起一种高效、灵敏、特异性强的阪崎肠杆菌分离方法，为该菌的精确检测奠定基础。

1 实验部分

1.1 菌株

阪崎肠杆菌（ATCC 29544）、阪崎肠杆菌（ATCC51329）、大肠杆菌（ATCC 25922）、肠炎沙门氏菌（CMCC（B）50041）、金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）、单增李斯特菌（ATCC19115）均购自上海桑戈生物科技有限公司。

1.2 试剂与仪器

吗啉乙磺酸 （MES，SIGMA）；碳二亚胺（EDC，SIGMA）；N- 羟基琥珀酰亚胺（NHS，SIGMA）；链霉亲和素（SA，SIGMA）；活泼酯化的长链生物素（Biotin，Pierce）；兔抗阪崎肠杆菌多克隆抗体（北京solarbio订制）；其他分析纯试剂（上海国药集团化学试剂有限公司）；C503021BCA蛋白质定量检测试剂盒（上海生工生物工程有限公司）。

EVM-80垂直旋转混匀仪（美国 Essenscien）；Multiskan MK3酶标仪（美国Thermo）；MS-12奥磁多功能磁分离器（上海奥润纳新材料有限公司）；PM3-008羧基磁珠（平均粒径80 nm）；PM3-035羧基磁珠（平均粒径 350 nm）；PM3-100羧基磁珠（平均粒径 1 μm）（上海奥润微纳新材料科技有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 抗体的生物素标记

按照Pierce公司说明书，将溶解于磷酸盐缓冲液（PBS,pH 7.0）的生物素与抗体按照物质的量比3∶1混合，标记后产物于4℃透析72 h，以体积比1∶1加入甘油，保存于-20℃备用。

1.3.2 磁珠与链霉亲和素（SA）的偶联

活化：取10 mg羧基修饰磁珠，依次用无水乙醇、1 mol/L NaOH、1 mol/L HCl及0.01 mol/L吗啉乙磺酸溶液（MES,pH 6.0）洗涤。用4℃的MES溶液（0.01 mol/L,pH 6.0）分别配制5 mg/mL的EDC和NHS溶液，向磁珠中分别加入等体积上述EDC和NHS溶液，置于垂直旋转混匀仪上保持磁珠悬浮，37℃活化45 min，磁分离器回收磁珠，PB溶液（0.02 mol/L,pH 8.0）洗涤3次后重悬。偶联：取活化后的磁珠与适量链霉亲和素进行偶联，37℃反应1 h。磁分离器回收磁珠。封闭：加入含1%牛血清白蛋白（BSA）的 PBS溶液（pH 8.0）重悬磁珠，37℃封闭45 min。保存：PBS溶液（pH 8.0）洗涤磁珠3次，用含0.05%Na3N的PBS（0.02 mol/L,pH 8.0）保存缓冲液重悬，4℃备用。偶联后用BCA法检测上清剩余链霉亲和素浓度，根据标准曲线计算单位质量磁珠和链霉亲和素偶联量及偶联效率。BCA试剂盒使用按照说明书进行。公式如下：

1.3.3 链霉亲和素免疫磁珠的合成

将1.3.2中获得的链霉亲和素磁珠和生物素化阪崎肠杆菌兔抗进行偶联，37℃反应30 min。磁分离器回收磁珠，PB溶液洗涤3次，用含0.05%Na3N的PBS（0.02 mol/L,pH 8.0）缓冲液重悬，4℃备用。抗体偶联率测定方法：采用BCA试剂盒测定磁珠偶联反应后上清液蛋白含量。

1.3.4 链霉亲和素免疫磁珠捕获效率

将阪崎肠杆菌（ATCC 29544）接种到LB培养基中，37℃振荡培养24 h，经平板涂布计数法计数后，用灭菌PBS溶液（0.01 mol/L,pH 7.0）将菌液浓度调整到105 CFU/mL，向1 mL菌液中加入适量链霉亲和素免疫磁珠，置于混匀仪上室温孵育。磁分离器分离3 min，弃上清，回收的磁珠用PBS清洗两次后重悬，将重悬液梯度稀释后进行菌落计数，每个梯度3个平行，培养温度为（37±1）℃，时间18～24 h，计算公式如下：

1.3.5 链霉亲和素免疫磁珠特异性评价

将实验室保存的阪崎肠杆菌（ATCC29544）、阪崎肠杆菌（ATCC51329）、大肠杆菌（ATCC 25922）、肠炎沙门氏菌 （CMCC（B）50041）、金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）、单增李斯特菌（ATCC19115）过夜培养后稀释到105～106 CFU/mL，然后分别向1 mL菌液中添加0.3 mg链霉亲和素免疫磁珠，置于混匀仪上室温孵育30 min。磁力架分离磁珠并用PBS重悬，将磁珠重悬液梯度稀释后进行平板菌落计数，之后步骤同1.3.4，用以评价免疫磁珠特异性。

1.3.6 免疫磁珠对人工污染样品中阪崎肠杆菌的捕获实验

称取奶粉、米粉各25 g，牛奶和蛋液（打匀）各25 mL，分别加入到225 mL PBS缓冲液中，按照105 CFU/mL接种阪崎肠杆菌，制备人工污染样品。取上述样品各1 mL，加入0.3 mg免疫磁珠，置于混匀仪上室温孵育30 min。磁力架分离磁珠并用PBS重悬，将磁珠重悬液梯度稀释后进行平板菌落计数，之后步骤同1.3.4，用以计算免疫磁珠在模拟样品中的捕获效率。

2 结果与分析

2.1 链霉亲和素免疫磁珠的制备

2.1.1 链霉亲和素和磁珠的偶联量及偶联效率

取同量经EDC、NHS活化的磁珠1 mg，分别加入10 μg、30 μg、50 μg、70 μg、100 μg、120 μg 的 SA 进行偶联反应，37℃反应1 h。结果如图1所示，随反应体系中SA添加量的提高，链霉亲和素的偶联量分别为6.5 μg/mg、19.1 μg/mg、28.9 μg/mg、38.4 μg/mg、51.2 μg/mg和52.8 μg/mg磁珠，偶联率为64.8%、63.8%、58.0%、54.8%、51.2%和44.0%，表明SA与磁珠的结合量随SA添加量的增大而增加，但偶联效率有所下降。考虑到制作成本，选取偶联量和偶联效率均较高的51.2 μg/mg磁珠组，即每mg磁珠中SA的添加量为100 μg进行后续实验。

图1 链霉亲和素加入量对偶联量和偶联效率的影响Fig.1 Effect of streptavidin amount on coupling and efficiency of magnatic beads

2.1.2 生物素化抗体与磁珠偶联量

取SA偶联量和偶联效率均较高的链霉亲和素磁珠（51.2 μg/mg磁珠，1 mg/份），加入生物素化免抗阪崎肠杆菌多克隆抗体。由于每个链霉亲和素分子有4个生物素结合位点，理论上生物素化抗体与链霉亲和素磁珠反应比值为4∶1，但考虑到空间位阻，按照抗体添加量与磁珠上链霉亲和素物质的量之比为1∶1，2∶1，3∶1，4∶1进行。结果如图2所示，生物素化抗体结合量随抗体添加比例的增大而增加。当抗体添加比例为3∶1时，抗体结合量分别为386.6 μg/mg磁珠，结合量趋向饱和。在保证吸附能力的同时，兼顾制备成本，免疫磁珠制备工艺确定为：按照100 μgSA/mg磁珠制备链霉亲和素磁珠，以抗体与磁珠表面链霉亲和素物质的量比为3∶1进行免疫磁珠的制备。

图2 抗体加入量对偶联量的影响Fig.2 Effect of antibody amount on coupling

2.2 菌体捕获条件的优化

2.2.1 免疫磁珠用量对捕获效率的影响

取4份浓度为105 CFU/mL的菌液各1 mL，分别加入 0.1 mg、0.2 mg、0.3 mg、0.5 mg磁珠，置于混匀仪上室温孵育30 min。磁力架分离磁珠后，PBS重悬磁珠进行菌落计数，计算免疫磁珠的用量对捕获效率的影响。结果如图3所示，随着免疫磁珠用量的加大，捕获效率不断提高。当磁珠用量为0.3 mg时，阪崎肠杆菌的捕获率为82.5%；磁珠用量为0.5 mg时，捕获效率为83.5%。表明当磁珠用量达到0.3 mg时，捕获效率趋于稳定，即使增加磁珠用量，捕获效率也没有明显提高，所以选择0.3 mg为最佳磁珠添加量。

图3 免疫磁珠添加量对捕获效率的影响Fig.3 Effect of immunomagnetic beads amount on adsorptio n efficiency

2.2.2 时间对捕获效率的影响

取4份浓度为105 CFU/mL的菌液各1 mL，分别加入0.3 mg免疫磁珠，置于混匀仪上室温孵育15 min、30 min、45 min、60 min。磁力架分离磁珠，PBS重悬，梯度稀释后进行菌落计数，计算不同捕获时间的捕获效率。结果如图4所示，不同孵育时间的捕获效率分别为70.5%、82.9%、84.3%和84.0%，说明孵育时间为30 min时达到平衡，即使延长孵育时间，捕获率也没有明显提升，因此选择30 min为最优捕获时间。

图4 孵育时间对捕获效率的影响Fig.4 Effect of incubation time on adsorption efficiency

2.2.3 免疫磁珠粒径对捕获效率的影响

分别选用磁珠 PM3-008（平均粒径 80 nm）、PM3-035（平均粒径350 nm）、PM3-100（平均粒径1 μm）按照最优方案制备链霉亲和素免疫磁珠，在磁珠添加量为0.3 mg、孵育时间30 min条件下计算捕获效率。图5结果说明，在纯培养体系中捕获效率和磁珠粒径成反比，粒径为80 nm、350 nm和1 000 nm的免疫磁珠捕获效率分别为83.5%、66.5%和23.0%，纳米磁珠表现优于微米磁珠。

图5 磁珠粒径对捕获效率的影响Fig.5 Effect of particle size of immunomagnetic beads on adsorption efficiency

2.3 链霉亲和素免疫磁珠特异性评价

利用粒径为80 nm的免疫磁珠对2株阪崎肠杆菌和4株非阪崎肠杆菌菌株分别进行捕获实验，图6结果显示对2株阪崎肠杆菌的捕获效率达到80%以上，而对4株非阪崎肠杆菌的捕获效率均不超过5.0%，推测是由于非特异性吸附造成的。在4株非阪崎肠杆菌和1株阪崎肠杆菌混合菌液中进行捕获，对阪崎肠杆菌的捕获效率为80.5%，几乎不受其他杂菌的影响，说明本实验制备的免疫磁珠特异性高，抗干扰能力较强。

图6 免疫磁珠特异性实验Fig.6 Test of specificity of immunomagnetic beads

2.4 免疫磁珠对人工污染样品中阪崎肠杆菌的捕获效率

免疫磁珠在模拟样品中的捕获效率均低于纯培养中的捕获效率，在米粉、奶粉、牛奶、蛋液中的捕获效率分别为70.8%、79.5%、78.0%和61.1%。其中在牛奶和奶粉中的捕获效率接近纯培养捕获效率，在蛋液中的捕获效率最低，推测由于牛奶、奶粉模拟样品的粘度较小，而蛋液粘稠度过高，影响免疫磁珠的流动性，阻碍磁珠与菌体的接触，干扰捕获，见图7。

图7 不同人工污染样品对捕获效率的影响Fig.7 Effect of different artificial pollution samples on adsorption efficiency

3 讨论与展望

在磁珠粒径对捕获效率影响实验中，结果显示纳米级磁珠优于微米磁珠，同样的结果在之前的研究中也多次被证明。钟子清等[9]比较了180 nm和1 150 nm粒径免疫磁珠对单增李斯特菌的捕获效果，结果显示，当磁珠用量为0.1 mg时，180 nm链霉亲和素免疫磁珠捕获效率高达95%，而1 150 nm磁珠仅为9%，并通过电镜观察结果证实。山珊等[10]研究发现在相同条件下，1 150 nm免疫磁珠对沙门氏菌的捕获效率不足180 nm免疫磁珠的一半。本次实验的结果也很好地印证了这一观点，粒径80 nm的免疫磁珠捕获效率最高。分析原因有三点：第一，纳米磁珠比表面积大，受到的空间位阻效应小，和菌体表面抗原表位的结合量提高；第二，菌体表面结合的免疫磁珠数量增加后，在磁分离过程中菌体脱离免疫磁珠的可能性降低；第三，纳米磁珠由于粒径小，在溶液中分散性更好，热运动作用比微米磁珠强，和菌体抗原表位接触的概率增加。而微米级免疫磁珠存在较大的空间位阻效应，导致磁珠与菌体结合位点减少，不但不易捕获到菌体，及时捕获后也容易在磁分离时脱离。

本实验制备了链霉亲和素——生物素介导偶联的免疫磁珠，用于捕获阪崎肠杆菌。由于链霉亲和素与生物素间极高的亲和力，此种方法比抗体直接和磁珠偶联的方法能够在单位质量磁珠表面结合更多抗体，从而提高捕获效率。在1 mL体系中添加粒径为80 nm的链霉亲和素免疫磁珠0.3 mg孵育30 min，纯培养条件下对阪崎肠杆菌捕获效率在80.5%以上，人工污染样品条件下捕获效率可达61.1%以上，非特异性低于5.0%，为进一步优化富集体系提供了研究方向。如果结合核酸提取、荧光定量PCR技术等，不但大大缩短致病菌的检测时间，而且将大幅提高检测的灵敏度和特异性。

在实验中发现捕获菌体过程中，免疫磁珠的利用度不高，体系中添加的免疫磁珠量远高于理论计算值，大量磁珠分散在缓冲体系中未得到有效利用，造成了浪费。在今后的研究中一方面要增加抗体的亲和力，另一方面要研究免疫磁珠的再生，测试不同洗脱试剂的洗脱效率，以及磁珠使用次数和捕获效率的关系，进而降低使用成本，促进免疫磁珠在致病菌检测中的应用和推广。