PMA对4-HPR抑制HepG2细胞体外迁移的影响

张 玲，魏 翔，张素梅，周 青，汪 渊

肝癌是常见肿瘤，在我国发病率较高，早期难发现，诊断时多已中晚期。侵袭转移往往是导致治疗欠佳的主因。乙酸肉豆蔻佛波醇(phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA)是一种从巴豆油中提取的化合物，初期研究具有较高的促癌活性[1]。研究[2]显示PMA可诱导白血病细胞分化。N-(4-羟基苯基)维生素甲酰胺[N-(4-hydroxyphenyl)retinoide, 4-HPR]是全反式维甲酸(all-trans-retinoic acid, ATRA)的一种人工合成衍生物，前期研究[3-4]显示可显著抑制肝癌细胞HepG2、肺癌细胞A549的迁移。该研究观察PMA对4-HPR抑制人肝癌细胞株HepG2体外迁移的影响，并对其作用机制进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1药物和试剂 PMA购自美国cayman公司；4-HPR购自美国MCE公司；ATRA购自上海东苍生物科技公司。均用二甲基亚砜(DMSO)配制成10 mmol/L母液，-20 ℃避光保存。DMEM培养基购自美国Hyclone公司；0.25%胰酶、BCA蛋白定量试剂盒购自北京碧云天公司；肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase，MLCK)、神经钙黏蛋白(N-cadherin)购自美国Abcam公司；肌球蛋白轻链(myosin light chain，MLC)购自美国Proteintech公司；磷酸化的肌球蛋白轻链(phosphorylated myosin light chain，p-MLC)购自美国Cell Signaling Technology公司；ECL试剂盒购自美国Thermo Fisher公司。

1.1.2主要实验仪器 倒置显微镜(DMI3000B，德国Leica公司)；电泳仪(DYY-11型，北京六一仪器厂)；化学发光成像仪(上海勤翔仪器公司)；低温离心机(Legend micro21R，美国Thermo Fisher公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养 将肝癌细胞HepG2培养在含10%小牛血清(杭州四季青生物公司)的DMEM培养基中，放置在37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中。当细胞长至80%～90%密度，用 0.25%胰酶消化传代。HepG2细胞株由安徽医科大学分子生物学实验室馈赠。

1.2.2实验分组、倒置显微镜下观察 实验分溶剂对照组(0.1% DMSO)、100 nmol/L PMA组、10 μmol/L ATRA组、10 μmol/L 4-HPR组、PMA+ATRA组、PMA+4-HPR组，共6组。待细胞长至40%～50%密度加药处理，48 h后倒置显微镜下观察，并拍照记录。

1.2.3细胞划痕实验 取处于对数生长期的HepG2细胞，胰酶消化吹打重悬为单细胞悬液，均匀种入24孔细胞培养板中。待细胞长成单层即弃去培养液，用200 μl枪头在24孔板每孔中央划出一痕，洗去死细胞后显微镜下拍照作为0 h。药物处理24 h和48 h，在同一观察点处拍照记录这两个时间点细胞划痕愈合情况，实验重复3次。利用Image Pro Plus软件测量各孔多点划痕距离，取均值，并用处理前的距离减去处理后的距离即为24 h、48 h的细胞迁移距离，数据用统计软件分析。

1.2.4Western blot检测细胞N-cadherin、MLCK的表达和MLC的磷酸化 收集药物处理48 h的细胞，分组同前，加入RIPA缓冲液( pH 7.4的Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1% TRIton, 0.1% SDS，磷酸酶抑制剂)提取蛋白，BCA 法蛋白定量。取40 μg每孔蛋白上样，进行SDS-PAGE电泳。电转至PVDF膜上。5%脱脂奶粉封闭2 h，加入兔源单克隆抗体MLCK、兔源多克隆抗体MLC、鼠源单克隆抗体p-MLC、N-cadherin 4 ℃孵育过夜，经TBST洗涤后再加入相应浓度的二抗室温孵育2 h，洗涤后用ECL试剂盒反应，在化学发光成像仪上显影拍照记录。以Image Pro Plus软件进行灰度扫描，分析各条带的灰度值，分别以p-MLC/MLC、MLCK/β-actin、N-cadherin /β-actin进行比值计算作半定量分析。实验重复3次，取其均值。

2 结果

2.1不同处理组HepG2细胞生长和形态变化药物处理48 h，显微镜下可见溶剂对照组和PMA组、PMA+ATRA组细胞密度大，光泽度好(图1A、1B、1D)。ATRA组细胞密度略有减少(图1C)。4-HPR组细胞数明显减少，失去正常生长， PMA+4-HPR组表现更为明显，形态更为细长，多核细胞减少(图1E、1F)。

2.2不同处理组对HepG2细胞迁移的影响药物处理24 h的细胞，与溶剂对照组(迁移距离178±26.5 μm)相比， PMA组(迁移距离237±32.6 μm)细胞的迁移距离增加(F=4.469，P<0.05)，4-HPR组(迁移距离93±22.0 μm)和PMA+4-HPR组(迁移距离99±6.4 μm)细胞的迁移距离减少(F=8.653，P<0.05)。药物处理48 h的细胞，与溶剂对照组(迁移距离346±19.3 μm)比较，PMA组(迁移距离429±20.1 μm)细胞的迁移距离仍增加(F=6.386，P<0.05)， 4-HPR组(迁移距离140±26.6 μm)和PMA+4-HPR组(迁移距离128±14.2 μm)细胞的迁移距离仍减少(F=47.34，P<0.05)。以上数据说明PMA单独处理可以增加肿瘤细胞的迁移距离，而和4-HPR联用后，促迁移能力消失，转为抑制效应(图2～3)。图2中同时观察到PMA+4-HPR组划痕边界的细胞形态更为细长，排列较稀疏。提示二者联用作用时间若延长，对细胞迁移的抑制可能更显著。

2.3不同处理组对HepG2细胞迁移相关蛋白表达的影响Western blot结果分析表明PMA+4-HPR组、4-HPR组可明显降低MLCK、N-cadherin的表达和MLC的磷酸化(FMLCK/β-actin=128.385、FN-cadherin/β-actin=39.871、Fp-MLC/MLC=35.378，P<0.05)。PMA+4-HPR处理组相比4-HPR组，MLCK、MLC的磷酸化降低更显著(P<0.05)。见图4。

图1 倒置显微镜观察PMA、4-HPR处理后HepG2细胞的生长 ×100

图2 细胞划痕实验检测PMA、4-HPR处理后HepG2细胞的迁移 ×100

图3 细胞划痕实验迁移距离统计

与24 h溶剂对照组比较：*P<0.05；与48 h溶剂对照组比较：#P<0.05

3 讨论

肝癌是一种恶性度很高的肿瘤，临床上目前除了手术治疗和介入治疗外，没有十分有效的方法。应用于肝癌的化疗药物有限，需要探寻新的药物。ATRA在八十年代已用于诱导急性早幼粒细胞白血病的分化治疗[5]。4-HPR是ATRA的类似物，国外用于乳腺癌、前列腺癌、神经母细胞瘤的研究均已进入临床实验阶段[6-8]。本课题组前期研究[3-4,9]显示，与同浓度ATRA相比，4-HPR能更有效抑制肺癌A549细胞、肝癌HepG2细胞的增殖和迁移。考虑到维甲酸类化合物长期使用的毒副反应，本研究中引入白血病细胞研究常用的诱导分化剂PMA，观察到PMA单独处理促进肝癌HepG2细胞迁移，但和4-HPR联用能显著抑制细胞迁移和增殖，并改变细胞的形态，联用药时PMA是否表现出诱导分化作用需要进一步实验验证。而4-HPR前体ATRA与PMA的联用没有相类似的效应。一方面说明4-HPR药效强于ATRA，另一方面提示PMA的作用通路和4-HPR相关，二者的联用不仅取消了PMA的促迁移效应，反而表现出强烈的抑制迁移作用。

N-cadherin又称神经钙黏蛋白，主要在神经细胞、内皮细胞等间充质细胞中表达。研究[10]显示其可在多种肿瘤中上调表达，且与肿瘤侵袭性增强相关。本研究中N-cadherin在对照组中表达量大，在细胞迁移减慢的PMA+4-HPR组和4-HPR组表达明显减少(P<0.05)。表明药物的使用可能抑制了肝癌细胞的迁移。MLCK是一种蛋白激酶，其激活可使MLC磷酸化，进一步有利于肌球蛋白和肌动蛋白微丝之间的作用，促进细胞移行。国外报道[11]显示在一些类型细胞迁移过程中，MLCK和激活的肌球蛋白在细胞的突出结构中含量丰富。近年亦有研究[12]指出MLCK给予鼠神经腺瘤细胞缓慢并有方向性的移动。本课题前期研究[3-4]显示在迁移受到抑制的肿瘤细胞中，MLCK和磷酸化MLC(p-MLC)蛋白表达水平均有减少(P<0.05)。本次研究中MLCK和p-MLC的表达在PMA+4-HPR组表现出比4-HPR组更显著的减少(P<0.05)。这提示PMA和4-HPR的联用可能存在协同作用。有研究[13]显示PMA上调白血病细胞的黏附能力并且抑制其迁移。尽管划痕实验没有显示出PMA+4-HPR组和4-HPR组肝癌细胞迁移能力的显著差异，若延长药物作用时间或改用细胞迁移能力的其他检测方法，可能会有更多的发现。

图4 Western blot检测PMA、4-HPR对HepG2细胞迁移相关蛋白表达的影响

A：p-MLC/MLC；B：MLCK/β-actin；C：N-cadherin/β-actin；1：ATRA+PMA组；2：ATRA组；3：溶剂对照组；4：PMA组；5：4-HPR组；6：4-HPR+PMA组；与溶剂对照组比较：*P<0.05；与4-HPR组比较：#P<0.05

本研究是对PMA和4-HPR联用以抑制肝癌细胞体外迁移的初步探查，为进一步深入研究打下基础，同时为改善4-HPR单独使用的不良反应，以期应用于肝癌的临床治疗提供实验依据。