重组人甲状旁腺激素对SLA纯钛表面MC3T3-E1细胞黏附的影响

傅琪淋, 朱中焰, 刘 敏

作为与生物材料间相互作用的第一阶段，成骨细胞在种植体表面的黏附情况是影响成骨的重要因素之一。因此，为获得高种植成功率，加快钛种植体与骨组织形成骨整合的速度是目前许多学者研究的热点。重组人甲状旁腺素(1-34)[human recombinant parathyroid hormone，rhPTH(1-34)]，商品名特利帕肽(Teriparatide)，作为目前唯一通过食品药品监督管理局批准的促合成代谢类药物，研究[1-2]表明其具有应用于口腔种植及牙周领域，促进新骨形成及种植体与周围骨组织形成骨整合的潜力。目前体外研究[3-5]结果显示，rhPTH(1-34)可能是通过活化种植体周围成骨细胞增殖与分化促进骨整合形成。由于种植体植入初期成骨细胞的黏附情况对骨整合的形成至关重要，但尚未有文献显示rhPTH(1-34)对成骨细胞黏附的影响。该课题从细胞及分子水平初步研究rhPTH(1-34)对成骨细胞在SLA钛表面初期黏附功能的影响。

1 材料与方法

1.1主要材料和设备小鼠成骨前体细胞株MC3T3-E1购自西南医科大学口颌面修复重建和再生实验室；rhPTH(1-34)购自上海吉尔生化有限公司；CCK-8 试剂盒购自上海贝博公司；TA2型商业纯钛购自陕西宝鸡特殊钢厂；总RNA抽提试剂盒购自北京tiangen有限公司；ReverTra Ace qPCR RT Master Mix、SYBR Green Realtime PCR Master Mix购自日本TOYOBO公司；喷砂机购自北京荣辉机械设备有限公司；扫描电子显微镜SEM购自荷兰FEI公司；X射线能谱仪购自英国Oxford公司；Image-Pro Plus图像分析系统购自美国Media Cybernetics公司。

1.2纯钛的表面SLA处理及材料学表征将直径10 mm厚度1 mm的圆形钛片，用400、600、800、1200# 碳化硅砂纸抛光，110 μm三氧化二铝(A1203)颗粒喷砂，喷砂处理时喷砂头与钛片表面保持垂直50 mm的距离，均匀转动喷射30 s。依次分别使用丙酮、无水乙醇、75%乙醇和去离子水(deionized water, dH2O)在超声波清洗器中清洗钛各10 min，室温干燥1 h。用混合酸(18%盐酸和49%硫酸混合物)在60 ℃水浴预热条件下酸蚀处理钛片30 min。dH2O超声清洗钛片30 min，高温、高压灭菌，紫外灯照射30 min，保存于密闭避光容器中。采用扫描电镜(SEM)观察各组钛片的表面形貌,用粗糙度测试仪测量大颗粒喷砂酸蚀(sand-blasted large grift acid-etched,SLA)处理后钛片表面粗糙度，采集数据得到轮廓算数平均偏差(roughness average,Ra)值，随机测量3个区域，取平均值。

1.3最适rhPTH(1-34)浓度的测定常规复苏传代培养MC3T3-E1细胞，将细胞分为6组，实验组分别为10-9mol/L rhPTH(1-34)一次性给药，10-7mol/L、10-8mol/L、10-9mol/L、10-10mol/L rhPTH(1-34)间歇性给药(每24 h的前6 h给予含rhPTH(1-34)培养基，从第7小时开始更换为培养液)，空白培养基作为对照组。6组均分别对细胞进行预孵24 h后，将密度为5×107cells/L的细胞接种于钛片上。第0.5、1、2、4、8小时用CCK 8法检测各组吸光度(optical delnsity,OD)值，实验重复3次，确定rhPTH(1-34)的最佳作用浓度用于后续实验。

1.4MC3T3-E1细胞的黏附数量及形态学改变实验组和对照组分别用含最适浓度rhPTH(1-34)的培养基和空白培养基对MC3T3-E1细胞预孵24 h后，将细胞接种于钛片上。在第4、8小时进行多聚甲醛固定后，TRIton透膜、DAPI避光染色后，对钛片表面黏附的MC3T3-E1细胞进行细胞计数，免疫荧光显微镜观察成骨细胞肌动蛋白微丝以及细胞形态学变化。上述同样方法24 h预处理细胞接种于钛片上，在第4、8 小时戊二醛固定后乙醇梯度脱水、喷金后扫描观察MC3T3-E1细胞黏附形态及铺展情况。

1.5MC3T3-E1细胞整合素亚基α1、α5、β1的表达水平实验组和对照组分别用含最适浓度rhPTH(1-34)的培养基和空白培养基对MC3T3-E1细胞预孵24 h后，在第1、3、5天提取总RNA，通过q PCR检测整合素亚基α1、α5、β1表达情况。

1.6统计学处理采用SPSS 22.0软件进行统计分析，对不同时间各组试件表面附着细胞计数结果行单因素方差分析，对同一时间点实验组和对照组比较，采用t检验。以双侧P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1纯钛表面形貌及粗糙度SLA处理后钛片表面检测SEM显示：钛片表面粗糙，呈弹坑状；表面粗糙度测量Ra=1.070 8 μm。

2.2最适rhPTH(1-34)浓度0.5 h时实验组与对照组间比较(F=0.119，P>0.05)，OD值差异无统计学意义；1 h时，实验组与对照组间比较(F=0.523，P>0.05)，OD值差异无统计学意义；2 h时，实验组各浓度与对照组比较，除浓度10-7mol/L组(F=0.182,P>0.05),差异无统计学意义外，其余实验组OD值上调，差异有统计学意义(P<0.05)；4 h时，实验组各浓度与对照组比较，浓度10-9mol/L、10-8mol/L组OD值均有上调(F=0.001、F=0.009,P<0.05), 差异有统计学意义；8 h时，实验组各浓度与对照组比较，浓度10-9mol/L、10-8mol/L组OD值均有上调(F=0.002、F=0.048，P<0.05)，差异有统计学意义；2、4、8 h组间比较显示：相对于其余组，浓度10-9mol/L细胞黏附数目最多，差异有统计学意义(P<0.05)。见表 1。

2.3MC3T3-E1细胞黏附数目在第4 、8 小时同一时间点，细胞计数结果见表2，实验组比对照组细胞黏附数目更多，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4MC3T3-E1细胞形态

2.4.1免疫荧光观察细胞形态 细胞核染色后激发光为蓝色荧光，纤维状肌动蛋白微丝F-action染色后激发光显示为绿色荧光。实验组细胞伸出丝状伪足较多，细胞间伪足相互交联，部分细胞隐约可见纤维状肌动蛋白微丝F-action呈束状，沿细胞伸展方向排列。对照组胞体部分可见呈类梭形及类椭圆形，亦伸出伪足，但伪足较为圆钝，细胞铺展差，F-action成网状，无明显束状结构。见图1。8 h时，细胞较对照组伪足更粗更长，细胞呈明显的多角形，细胞间连接更为紧密。见图2。

2.4.2SEM显示 实验组钛表面黏附的成骨细胞数目较多，伸出丝状伪足嵌入钛表面窝洞中，形成成骨细胞典型的多角形形态，细胞胞体平铺伸展面积较大。对照组成骨细胞数目较少，胞体呈类梭形，表面初步伸出丝状伪足，数目较少。见图3。

2.5整合素ɑ1、ɑ5、β1基因表达情况实时荧光定量PCR(RT-PCR)测定实验组和对照组细胞分别在第1、3、5天时，整合素ɑ1、ɑ5、β1表达量基因的表达情况。见表3。通过采用 2-ΔΔCt法，计算出各组在各个时间点，实验组ɑ1、ɑ5、β1的基因表达水平均明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 各组MC3T3-E1细胞在不同时间点OD值

与对照组比较：*P<0.05

图1 接种后4 h倒置荧光显微镜下观察细胞形态 ×400

A：对照组；B:实验组；1：细胞核染色图像；2：纤维状肌动蛋白微丝F-action染色图像；3：细胞核和肌动蛋白微丝同时显色图像

图2 接种后8 h倒置荧光显微镜下观察细胞形态 ×400

A：对照组；B:实验组；1：细胞核染色图像；2：纤维状肌动蛋白微丝F-action染色图像； 3：细胞核和肌动蛋白微丝同时显色图像

表2 各组MC3T3-E1细胞计数

与对照组比较：*P<0.05

图3 扫描电镜下观察细胞形态 ×1 200A：对照组 B:实验组；1：接种后4 h；2：接种后8 h

表3 RT-PCR检测整合素ɑ1、ɑ5、β1表达量

与对照组比较：*P<0.05

3 讨论

在种植体植入初期，成骨细胞必须与其附着的材料表面发生适当的黏附才能进行迁移和增殖[6]。本实验通过研究rhPTH(1-34)对成骨细胞在SLA钛表面初期黏附功能的影响，近一步了解rhPTH(1-34)对骨整合的作用，为rhPTH(1-34)能否用于增加种植体初期成骨作用提供参考。成骨细胞在钛表面黏附数量的影响因素，主要有生物学因素和材料因素。本实验SLA处理后钛片表面粗糙度检测结果显示Ra=1.070 8 μm，根据Mustafa et al[7]观察表面粗糙度对细胞附着、增殖和分化的影响等研究，实验所用钛片粗糙度有利于成骨细胞的黏附聚集，符合体外实验要求。

细胞的黏附根据细胞形态变化可分为4个连续又相互重叠的变化时相，即细胞附着、细胞铺展、肌动蛋白细胞骨架的重组和黏着斑的形成。体外培养的成骨细胞属于贴壁生长的细胞，在接种后1 h内，细胞主要是物理沉降和吸附过程。在细胞附着后，伴随少量细胞形状的变化及铺展,整合素相关的信号通路活化，介导细胞与生物材料发生结合。然后整合素与胞内的细胞骨架肌动蛋白通过黏着斑相连，使细胞能在细胞外基质(extracelluar matrix，ECM)产生力作用点，从而能使细胞形态改变，呈现出细胞不同功能状态[8]。

根据上述细胞黏附过程中的一系列变化，可以解释本实验中不同浓度rhPTH(1-34)对MC3T3-E1细胞黏附数量的影响所得结果以及实验中观察到的细胞形态变化。通过CCK8法研究不同浓度rhPTH(1-34)对MC3T3-E1细胞黏附数量的影响时，在最初的0.5～1 h，对照组与实验各组结果间差异均无统计学意义。可能是因为1 h内，成骨细胞主要是物理沉降和吸附过程。在第2、4、8 小时时，实验组与对照组OD值具有显著差异，并且DAPI染色细胞计数也显示实验组在钛片上黏附数目更多。原因可能是rhPTH(1-34)通过促进黏附过程中整合素表达及细胞微丝骨架重组等，加速细胞黏附过程。

本研究结果显示实验组的成骨细胞不仅发生一系列形态变化而且变化更快。丝状伪足的增加，可以增加细胞的接触面积和黏附强度，从而促进细胞信号传导级联的活化，这可以解释rhPTH(1-34)的正向成骨效果。除此之外，在体内外环境中，成骨细胞可以通过改变肌动蛋白微丝的排序来对物理和化学刺激作出反应。微丝骨架的重构是改变细胞形态和细胞在生物材料表面黏附的必然条件。在同一时间段内，图1显示的实验组和对照组细胞形态差异，表明rhPTH(1-34)能促进成骨细胞肌动蛋白微丝的重构，加快在钛片上黏附进程。

整合素是由α和β亚基非共价键结合的异二聚体，在细胞的黏附过程中起着重要作用。本实验选取了具有代表意义的整合素亚基α1、α5、β1基因进行定量检测。研究[9-10]显示，整合素β1与α1或α2介导成骨细胞的初期黏附和细胞铺展。研究[11]表明整合素α5、β1明显促进成骨细胞在钛表面的黏附，提示整合素α5、β1参与了成骨细胞和ECM之间的黏附。结合本实验中RT-PCR的结果，rhPTH(1-34)可能是通过上调整合素ɑ5、β1基因表达，促进细胞在钛表面的黏附。然而，rhPTH(1-34)促成骨细胞黏附是否是通过整合素介导以及相应信号通路机制，尚需进一步研究。