TMPRSS4亚型的新发现及其对转染结肠癌细胞的生物学特性研究

赵雪峰，许广大

临床上遇到的结肠癌(colon cancer, CC)，虽然病理类型、临床分期、治疗方案相同，但其预后和转归截然不同[1]。其缘由可能是分子水平上高度异质的CC之间存在遗传背景、肿瘤分型及治疗敏感性的差异。随着分子生物学技术的不断进步，将会提高对CC分子生物学机制的认知，有助于构建分子分型的诊治模式，有望提升CC个体化治疗。跨膜丝氨酸蛋白酶4 (transmembrane protease serine 4, TMPRSS4)是分泌型蛋白水解酶，其生物学特性及肿瘤演进中的作用机制尚未完全清楚，但在上皮细胞来源的诸多恶性肿瘤的侵袭和转移中的作用渐渐得到了相应的肯定[2-4]。研究组在TMPRSS4 mRNA制作过程中，发现比TMPRSS4长约130 bp的同源mRNA，并命名为TMPRSS4亚型。该研究首先鉴定转染到人CC细胞(DLD-1)中的TMPRSS4亚型；其次，阐明稳定型转染细胞的迁移和侵袭能力。

1 材料与方法

1.1主要试剂及特殊设备TMPRSS4抗体购自美国Protein Tech公司；GAPDH抗体购自美国Santa Cruz公司 ；TRIzol 购自美国Invitrogen公司；热循环PCR仪购自日本TaKaRa公司 ；划痕实验专用培养插件购自德国Ibidi公司；聚碳酸酯滤膜购自英国Neuro Probe公司；快速血液涂片染色液试剂购自德国Merck KGaA公司；微震仪 (Microporator MP-100)购自韩国Nano Entek公司。

1.2TMPRSS4亚型的基因克隆、测序及结构设计根据TMPRSS4全长cDNA序列，首先设计引物，见表1。分别在引物前加上两种限制性内切酶(Hind Ⅲ和Xho I)识别序列及接头，并通过PCR方法从克隆真核细胞表达空白载体(plasmid complementary deoxyribonucleic acid, pcDNA6； 美国BD公司) 的质粒中扩增TMPRSS4亚型基因。测序分析并与相似序列进行同源性比较，并依据外显子(Exon)7或Exon9-2的缺如与否，将TMPRSS4亚型分为4种，此亚型分别命名为T4-1A (T4-1a1和T4-1a2)及T4-1B(T4-1b1和T4-1b2)。所设计并预测的TMPRSS4亚型的基因和蛋白质结构见图1、2。

表1 引物设计

图1 TMPRSS4亚型基因结构

图2 预测TMPRSS4亚型蛋白质结构

1.3TMPRSS4亚型的稳定型转染细胞构建DLD-1(美国ATCC公司)在含10%血清RPMI 1640培养液中传代培养，细胞密度在60%～80%融合并附着时进行转染。采用微震仪将TMPRSS4(T4-1)、TMPRSS4亚型(T4-1A和T4-1B)及pcDNA6(PC6)质粒转染到DLD-1中。T4-1、T4-1A、T4-1B及PC6转染DLD-1传代培养并液氮保存，并使其构建成生长或表达稳定的细胞株。

1.4RT-PCR(mRNA水平上鉴定TMPRSS4亚型) 收集2015年1月～2月在大连大学附属新华医院实施CC根治手术的8例癌组织及其配对癌旁相对正常黏膜组织，其新鲜标本取材后保存在液氮中，备行RT-PCR检测。离心收集T4-1、T4-1A、T4-1B及PC6转染DLD-1和未进行任何处理的DLD-1原始对照组(Parental)，TRIzol试剂盒提取RNA，测量RNA纯度和浓度，电泳检测RNA完整性，热循环PCR仪进行逆转录反应及PCR扩增。

1.5Westernblot(蛋白质水平上鉴定TMPRSS4亚型) 将T4-1、T4-1A、T4-1B及PC6转染DLD-1进行蛋白提取、定量并调整各组总蛋白含量相等，SDS-PAGE电泳和电转移。检测时将稀释成1 ∶1 000的TMPRSS4抗体和稀释成1 ∶4 000的GAPDH抗体置入4 ℃冰箱过夜，并在暗室曝光显影。

1.6划痕实验(转染细胞的迁移能力) 细胞迁移能力的测量采用60 π 划痕实验专用培养插件。将细胞密度设定为2×105/100 μl的T4-1、T4-1A、T4-1B及PC6转染DLD-1或Parental DLD-1播种在伤口愈合实验专用培养插件中。细胞孵化24 h后创建500 μm 原始划痕间隙，并采用显微镜捕获自创建原始划痕间隙后进行0～72 h的划痕闭合间隙。

1.7侵袭实验(转染细胞的侵袭能力) 将细胞密度设定为1×104/350 μl的T4-1、T4-1A、T4-1B及PC6转染DLD-1或Parental DLD-1播种在博伊登室 (Boyden chamber)中。细胞孵化24 h后，采用快速血液涂片染色液试剂染色穿透基底胶或黏附在聚碳酸酯滤膜的细胞。

1.8统计学处理采用SPSS 18.0软件进行统计分析。T4-1、T4-1A、T4-1B研究组与对照组的比较采用Student’st-test 进行统计分析， 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1TMPRSS4亚型的新发现在CC组织的TMPRSS4 mRNA研究过程中，显示比TMPRSS4表达相对较弱PCR产物，且比TMPRSS4长约130 bp的同源mRNA，命名为TMPRSS4亚型，见图3A。结果显示TMPRSS4亚型表达强度为TMPRSS4表达强度的10%左右，见图3B。

图3 TMPRSS4亚型的新发现

A：新的亚型；B：新的亚型与TMPRSS4表达强度比较

2.2TMPRSS4亚型的鉴定结果经测序分析明确，TMPRSS4亚型为TMPRSS4全长互补脱氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid, cDNA)序列中内含子(Intron) 9的一部分，此部分被确认为Exon9-1；在RNA水平上证实，此新型TMPRSS4亚型按Exon7或包含在Intron-9的另一部分Exon9-2的缺如与否，将TMPRSS4亚型分为4种；但按蛋白质结构预测结果可将TMPRSS4亚型分为T4-1A和T4-1B 2种。TMPRSS4亚型的蛋白质结构，包括TMPRSS4 蛋白酶结构域的3个功能活性位点中只缺损1个功能活性位点的38.5 ku大小蛋白质和功能活性位点全部缺损的29.2 ku大小蛋白质。成功构建T4-1A和T4-1B重组载体，并获得稳定型T4-1A和T4-1B转染细胞株。RT-PCR 结果见图4A，Western bolt 结果见图4B，结果表明T4-1A和T4-1B高表达于稳定型DLD-1。

图4 鉴定新发现的TMPRSS4亚型

2.3TMPRSS4亚型对转染CC细胞的生物学特性结果T4-1A与转染空白载体PC6比较，显著促进转染T4-1A的 DLD-1的迁移和侵袭，其差异有统计学意义(迁移能力，T4-1:t=14.993,P<0.01; T4-1A:t=8.205,P<0.05。侵袭能力，T4-1：t=-38.825,P<0.01;T4-1A:t=-42.42,P<0.05)；但T4-1B与PC6相比差异无统计学意义(P>0.05)，见图5、6。

3 讨论

由于TMPRSS4具有多种结构域的结构特性，且与多种成分发生反应、凝聚成传导信号复合体，还关联到细胞内、外的多种信号传导通路，因而涉及到肿瘤增长、侵袭、转移及血管生成等肿瘤发生、发展的任何阶段[5]。TMPRSS4不仅激活去整合蛋白和金属蛋白水解酶受体系统和尿激酶型纤维蛋白酶原激活剂/尿激酶受体系统，还牵连、调节黏着斑激酶、Ras相关C3肉毒素底物1、蛋白激酶、细胞外信号调节蛋白激酶、丝裂原活化蛋白激酶、c-jun氨基末端激酶等诸多信号传导通路[6-7]。Jung et al[8]采用小干扰核糖核酸干预了TMPRSS4表达，其结果显示CC细胞的增殖或迁移能力与正常对照组相比显著减弱。Ohler et al[9]研究表明，TMPRSS4可能在组织发育或细胞分化过程中发挥重要作用，并启动细胞外基质的降解来引发肿瘤的侵袭和转移。近年来，随着分子生物学的研究深入为CC的分子分型提供了重要依据，为CC的个体化治疗带来福音[10-11]。

图5 转染细胞的迁移能力 ×40

图6 转染细胞的侵袭能力 ×100

本研究证实T4-1A和T4-1B的开放阅读框序列中，可观察到部分引物缺失，其原因可能是利用了pcDNA6载体而产生的终止密码子；T4-1A和TMPRSS4生物学特性非常相似，但T4-1B获得相反结果。从生物学特性分析，真正的TMPRSS4亚型只有T4-1A，而T4-1B可能只是参与转录调节；Exon7、Exon9-1及Exon9-2具有各自的功能地位，从而可推理Intron-9在TMPRSS4或TMPRSS4亚型中的遗传学行为。由伦敦大学数据库(www.ucl.ac.uk/library)中搜查证实，本研究组显示的非突变型TMPRSS4亚型属首次报道，且至今尚未有类似研究报道。

综上所述，T4-1A和T4-1B是新的TMPRSS4亚型，而包含激活功能区的T4-1A可促使CC细胞的迁移和侵袭能力，并为进一步研究TMPRSS4的分子生物学特性提供理论基础。