CD64在RA患者单核细胞中的表达及与TNF-α的相关性研究

黄自坤，黄清水，李 雪，鞠北华，罗 清

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种病因尚不明确的难治性的自身免疫性疾病，全世界每年的发病率为1%～3%，其主要特点是不可逆的关节滑膜炎症和损伤[1]。越来越多的研究[2]表明单核细胞/巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等在多种层面上参与RA的致病。单核细胞/巨噬细胞可通过分泌大量的炎性细胞因子来维持RA患者的炎性环境以及招募大量的免疫细胞迁移至关节炎，导致关节不可逆的损伤。簇分化抗原64(cluster of differentiation antigen, CD64)是IgG Fc段受体Ⅰ(FcγRⅠ)，为高亲和性受体。CD64是连接机体体液免疫和细胞免疫的桥梁，在细胞吞噬、清除免疫复合物、抗原递呈和刺激炎性介质释放中发挥至关重要的作用[3]。Hepburn et al[4]研究发现RA患者单核细胞上CD64表达与正常对照者之间差异无统计学意义。Laurent et al[5]研究发现RA患者单核细胞上CD64的表达低于正常对照者。而Matt et al[6]研究表明RA患者单核细胞上CD64的表达升高，并且与疾病的活动程度相关。因此，CD64在RA患者单核细胞上的表达情况及其在RA中的具体作用还不是很明确。该研究通过流式细胞术检测RA患者和正常对照者外周血单核细胞表面CD64的表达，分析其与疾病严重程度和分泌细胞因子的关系，探讨CD64在RA发病机制中的作用。

1 材料与方法

1.1病例资料收集2016年6月～2017年6月于南昌大学第一附属医院风湿免疫科就诊的RA患者46例，其中女38例，男8例，年龄34～78(57.3±12.0)岁。所有的RA患者符合1987年美国风湿病学会(ACR)制定的RA诊断标准[7]，并排除其他严重疾病。正常对照组22例，为年龄和性别相匹配的健康体检者，其中女18例，男4例，年龄32～69(51.2±11.6)岁。详细收集RA患者临床资料及相关实验室检查结果，并进行RA疾病活动性评分(disease activity score 28, DAS28)[8]，根据评分将疾病组分为活动组(DAS28≥2.6分，38例)和稳定组(DAS28<2.6分，8例)。根据病程的长短将疾病组分为复发病例组(病程大于6个月，41例)和新发病例组(病程小于6个月，5例)[9]。所有的RA患者在采集标本前使用了相关抗风湿病药物的治疗。本实验经过医院伦理委员会批准，参加者知情同意。

1.2仪器和试剂Ficoll-Paque分离液购自美国Sigma公司；流式细胞抗体藻红蛋白标记的CD64抗体(phycoerythrin-CD64, PE-CD64)、PE标记的CD163抗体(PE-CD163)、PE标记的CD206抗体(PE-CD206)、PE标记的CD86抗体(PE-CD86)、异硫氰酸荧光素标记的CD40抗体(fluorescein isothiocyanate-CD40，FITC-CD40)、FITC标记的CD80抗体(FITC-CD80)、FITC标记的HLA-DR抗体(FITC-HLA-DR)购自美国eBioscience公司；藻红蛋白-得克萨斯红标记的CD14抗体(phycoerythrin-texas red，ECD-CD14)及相应的同型对照PE-IgGl和FITC-IgG1均购自美国Beckman Coulter公司。Cytomics FC 500流式细胞仪为美国Beckman Coulter公司产品，分析软件为仪器自带的CXP分析系统。

1.3外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)提取肘前静脉采集EDTA抗凝外周血5 ml，6 h内送检。采用Ficoll-Paque分离液(美国Sigma公司)提取RA患者和对照者的PBMC。

1.4流式细胞术检测单核细胞表面分子各取受试者100 μl 生理盐水重悬的PBMC加入5试管中，按以下组合加入单克隆抗体各10 μl: ECD-CD14、PE-IgGl、FITC-IgGl; ECD-CD14、PE-CD163、FITC-CD80; ECD-CD14、PE-CD206、FITC-CD40; ECD-CD14、PE-CD86、FITC-HLA-DR; ECD-CD14、PE-CD64，4 ℃避光孵育30 min，如有红细胞，则用红细胞裂解处理后，生理盐水洗涤，1 500 r/min离心5 min，弃上清液，重悬后用Cytomics FC 500流式细胞仪检测分析，使用CXP分析软件分析单核细胞(CD14+)CD163/CD206/CD40/CD64/CD86/CD80/HLA-DR的表达。

1.5流式细胞术检测CD64阳性和阴性单核细胞内肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α) 将分离的PBMC调整细胞数为5×109个/L接种于24孔细胞培养板，每孔1 ml，同时加入LPS干预(终浓度100 μg/L),置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养16 h后，用胰酶将其消化获取细胞，室温 1 500 r/min 离心 5 min ,弃上清液，用生理盐水洗涤后，再重悬细胞。加入流式抗体(10 μl ECD-CD14和 FITC-CD64)避光孵育 30 min，生理盐水离心洗涤，再加入500 μl破膜/固定剂，避光孵育 20 min， 经Perm /WashTM缓冲液洗涤并用100 μl 重悬细胞，再加入 10 μl PE-TNF-α抗体，避光孵育30 min。生理盐水洗涤后，重悬细胞。先以单核细胞设门，圈出CD64阳性和阴性两群细胞，再分别以CD64阳性和阴性的单核细胞设门，分别读取CD64阳性和阴性单核细胞胞内TNF-α 的表达。

1.6RA的其他实验室指标检测血沉(erythrocyte sedimentation rate, ESR)采用动态血沉仪法(北京普利生公司)，类风湿因子(rheumatoid factor, RF)和C-反应蛋白(C-reactive protein, CRP)采用速率散色比浊法(美国Beckman Coulter公司)，抗环瓜氨酸多肽抗体(anti-citrullinated protein antibodies, ACPA)采用酶联免疫吸附法(上海科新生物技术股份有限公司)。

2 结果

2.1RA患者及对照组外周血单核细胞的CD163/CD206/CD40/CD64/CD86/CD80/HLA-DR表达采用流式细胞术分析RA患者和正常对照组外周血单核细胞(CD14+)上CD163、CD206、CD40、CD64、CD86、CD80和HLA-DR表达水平，结果如表1所示，RA患者外周血CD64+单核细胞百分率为(94.64±0.92)%，正常对照组CD64+单核细胞百分率为(92.20±1.42)%，两组比较差异无统计学意义(P>0.05)；RA患者组外周血单核细胞CD64表达的平均荧光强度(mean fluorescence intensity, MFI)为(38.53±2.58)，显著高于正常对照组(28.14±1.64)，差异有统计学意义(P=0.010)；而外周血单核细胞上的CD163、CD206、CD40、CD86、CD80和HLA-DR表达水平在两组之间差异没有统计学意义(P>0.05)。

2.2RA患者外周血单核细胞上CD64表达与DAS28评分相关性分析结果如图1所示，RA活动组(DAS28≥2.6)和稳定组(DAS28<2.6)外周血单核细胞上CD64表达的MFI分别为(40.64±18.00)、(20.04±7.12)，差异有统计学意义(P=0.040)。RA患者外周血单核细胞上CD64表达的MFI与DAS28呈正相关性(rs=0.34,P=0.025)。

表1 RA组及对照组单核细胞表面CD163、CD206、CD40、CD64、CD86、CD80和HLA-DR的表达

图1RA患者外周血单核细胞上CD64表达与DAS28相关性分析

A：RA活动组外周血单核细胞上CD64表达MFI明显高于RA稳定组; B：RA患者外周血单核细胞上CD64表达MFI与疾病活动性评分DAS28呈正相关性

2.3RA患者外周血单核细胞上CD64表达与炎性指标相关性分析结果如图2所示，RA患者外周血单核细胞上CD64表达的MFI与ESR呈正相关性(rs=0.46,P=0.002)，RA患者外周血单核细胞上CD64表达的MFI与CRP呈正相关性(rs=0.50,P=0.002)。

2.4RA患者外周血单核细胞上CD64表达与自身抗体的关系结果如图3所示，RA患者ACPA阳性组外周血单核细胞上CD64表达的MFI高于对应的阴性组(P=0.048)，RA患者RF阳性组外周血单核细胞上CD64表达的MFI高于对应的阴性组(P=0.004)。

图2 RA患者外周血单核细胞上CD64表达与炎性指标相关性分析

A：RA患者外周血单核细胞上CD64表达MFI与ESR呈正相关性;B：RA患者外周血单核细胞上CD64表达MFI与CRP呈正相关性

图3 RA患者外周血单核细胞上CD64表达与自身抗体的关系

A：RA患者ACPA阳性组外周血单核细胞上CD64表达的MFI高于对应的阴性组; B：RA患者RF阳性组外周血单核细胞上CD64表达的MFI高于对应的阴性组

2.5新发和复发RA患者外周血单核细胞的CD64表达的比较结果如图4所示，外周血单核细胞上CD64表达的MFI在新发RA患者与复发RA患者之间的差异无统计学意义(P=0.265)。

2.6RA患者CD64+单核细胞的TNF-α水平结果如图5所示，RA患者 CD64+单核细胞表达的TNF-α水平明显高于CD64-单核细胞 (P=0.014)。

图4 新发RA患者和复发RA患者单核细胞上CD64表达

3 讨论

CD64是IgG Fc 段受体Ⅰ，为高亲和性受体，组成性的表达在单核细胞和巨噬细胞表面。虽然之前有关于RA患者单核细胞上CD64的表达研究报道，但其结果存在争议[4-6,10]。因此，本研究为深入了解CD64在RA发病机制中的作用，采用流式细胞术检测RA患者和正常对照者外周血单核细胞中CD64的表达，结果显示，RA患者外周血单核细胞上CD64的表达明显升高,并与DAS28呈正相关性，说明 CD64的表达水平与疾病活动性呈正比,患者疾病越严重,CD64的表达水平越高。不同研究其结果不一致可能原因是不同RA患者异质性较大，其病程、用药情况、自身抗体的状况、年龄和性别都有所差异，且其发病机制较为复杂。

本研究还分析了RA患者单核细胞中CD64的表达与炎症指标、自身抗体的相关性。在RA患者中，单核细胞CD64的表达与炎症指标CRP和ESR呈正相关性，且RA 患者单核细胞中CD64的表达水平与自身抗体密切相关。而近期研究[3-6]显示CD64作为高亲和力的IgG Fc 段受体，可促进单核细胞结合大量的抗体及抗原抗体免疫复合物，在刺激炎性介质释放及RA发病中发挥至关重要的作用，而本研究进一步证实了CD64+单核细胞可分泌更多的TNF-α等促炎细胞因子，提示CD64可作为RA严重程度的评价指标。此外，本课题组之前的研究也证实单核细胞亚群中的经典型和中间型CD64表达与与炎症水平、自身抗体产生和疾病活动性有明确的相关性，以及中间型单核细胞CD64 的表达与细胞因子相关[11]。这些结果进一步证实单核细胞上CD64的表达与RA的致病相关。

图5RA患者CD64+单核细胞的TNF-α水平

A：流式细胞检测CD64+单核细胞分泌TNF-α典型代表图; B：RA患者 CD64+单核细胞表达的TNF-α 水平明显高于CD64-单核细胞

RA是一种慢性炎性自身免疫性疾病，机体内存在大量的炎性细胞因子，已有研究证实IFN-γ和 G-CSF 等细胞因子可促进CD64的表达[12-13]。这就解释了在RA这种炎性环境中，患者的单核细胞CD64表达升高。

此外，需要指出的是，本研究还存在一些缺陷：① RA患者研究样本不够多，尤其是新发RA患者；② 没有检测未用药的新发RA患者以及没有直接检测用药前后新发RA患者的CD64表达差异,因此无法了解在没有药物干扰情况下,CD64在RA中的作用，以及药物对CD64表达的影响。本研究在后续的研究中将进一步扩大样本量检测未用药新发RA 患者以及用药前后CD64的表达情况，使研究结果更具有可靠性。