胃癌早期诊断与预后判断代谢组学研究进展＊

赵丽沙，吴人照，陈 伟，柴可群，董 宇，2＊＊

（1.浙江省中医药研究院中药研究中心 杭州 310007；2.浙江中医药大学第二临床医学院 杭州 310053）

一 胃癌概述

胃癌（Gastric cancer,GC）是最常见的消化道恶性肿瘤之一，是世界第三大癌症[1]。在全球范围内，每年新增胃癌病例约95.16 万例及相关死亡病例约72.31万例[2]，对人类健康和社会发展造成严重危害。胃癌是一种进展性疾病，其发生一般经历五个阶段，即慢性浅表性胃炎→慢性萎缩性胃炎→胃癌前病变（萎缩→肠化生→异型增生）→胃癌。由于胃癌早期常无特异性症状，多数患者就诊时已至中晚期，导致预后不良。据统计，晚期胃癌患者的5年生存率不足20%，而早期确诊并实施手术切除的患者，5 年生存率可达90%以上[3]，因此，胃癌的早期诊断并及时干预，对改善胃癌患者预后具有重要意义[4]。目前，胃癌的诊断主要是基于内镜和组织活检的病理检查，但这一方式创伤性大、成本高、患者依从率低，很难广泛应用于早期胃癌的临床筛查；而常见的胃肠道肿瘤标志物如CEA、CA72-4 和CA19-9 虽已被广泛应用于胃癌的诊断、筛查和治疗监测，但在胃癌的早期阶段诊断阳性率不足20%，不能满足胃癌早期筛查的要求；同时，当前胃癌病程判断及预后的主要依据依然是病理（包括组织学分型、侵袭性和转移），影像学表现（用于分期），以及其他的临床特点（年龄和基础疾病等），传统的临床病例特点具有明显的局限性且胃癌不同阶段之间的生物学行为及预后存在较大差异，已不能满足日益发展的临床需求。因此，开发非侵袭性、灵敏度高、特异性好的胃癌诊断及预后判断生物标志物具有重要的现实意义。

二 代谢组学介绍

图1 代谢组学代表性工作流程

代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后新近迅速发展的一门学科，用于研究生物体系（生物体液、组织、细胞等）由病理或生理刺激所导致的所有代谢产物变化的科学[5，6]。相比于其他组学研究面临的基因复杂性、转录后修饰等问题，代谢组学能够直接、全面反映机体内源性代谢信息改变[7-8]，并通过多元统计分析获得生物体特征代谢标记，是开展疾病预测、诊断、预后判断和药物疗效评价的先进技术手段。代谢组学研究常用的分析技术包括核磁共振（NMR[9]）、液相色谱-质谱（LC-MS[10]）、气相色谱-质谱（GC-MS[11]）、毛细管电泳-质谱（CE-MS[12]）等。NMR 是尿液和血液代谢组学分析中最常用的分析方法之一，其无损性、无偏性和代谢物识别为分子结构提供了详细的信息，但其灵敏度偏低，代谢物覆盖不全；GC-MS 主要针对具有挥发性的代谢产物，脂肪酸、有机酸和糖等代谢物是其主要检测对象；而CE-MS 则适合能量代谢研究，能够同时量化带电的低分子量化合物；相比之下，LC-MS 可以覆盖更为广泛的代谢物，包括挥发性和非挥发性化合物，是目前较为主流的代谢组学分析方法。

代谢组学研究一般是多组别，多中心之间的比较研究，样本量一般要满足大样本统计学意义，因此通常会获得大量的代谢产物原始数据，需要运用数据分析方法从复杂的数据中提取出有价值的信息，筛选出潜在的生物标志物。目前常用的代谢组学数据分析方法有单变量分析方法和多变量分析方法。单变量分析方法包括t检验、Wilcoxon秩和检验和Kruskal-Wallis检验等；多变量分析方法包括非监督的学习方法，如PCA、非线性映射（NLM）等，以及有监督的学习方法，如偏最小二乘判别分析（PLS-DA）、基于正交信号校正的偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）、人工神经网络（ANN）、支持向量机（SVM）等。其中，PCA、PLSDA和OPLS-DA是目前代谢组学领域中使用最为普遍的多变量统计分析方法。在实际应用中，通常先对数据进行预处理，包括包括归一化（standardization）、标准化（normalization），即中心化（centering）和尺度化（scaling），以及数据转换（transformation）；接着采用非监督模式识别方法对样本进行初步分类，借助监督模式方法建立预测模型，筛选差异代谢物；继而运用逻辑回归，将判别分析获得的差异代谢物进一步通过单因素和多因素逻辑回归，获取具有独立危险因素的差异代谢产物，并通过HMDB、Metlin、MetFrag、MassBank、XCMS online 等进行差异代谢物鉴定，或进一步采用Metaboanalyst 4.0、KEGG、BioCyc 等进行相关代谢通路分析。代谢组学主要流程见图1。

目前，代谢组学已广泛应用于多个研究领域[13-15]。在疾病早期诊断研究中，Lin Sun等[16]建立了基于NMR的血浆代谢组学和分类回归树（CART）分析方法的儿科结核病联合诊断模型，L-缬氨酸、丙酮酸和甜菜碱3种标志物的联合诊断模型的特异性、灵敏度、曲线下面积分别为94.6%、85.7%、0.984，可用于儿童结核病的诊断。在疾病的分型及病程进展研究中，Yong Fan等[17]采用代谢组学和生物信息学方法，首次绘制了冠心病及其不同临床阶段（冠脉硬化症、稳定型心绞痛、不稳定型心绞痛、心肌梗死）的血浆代谢组学特征谱，并筛选出12 组灵敏度＞85%、专属性＞85%的代谢标志物群，研究结果可应用于冠心病的早期诊断及高危人群的预警。在疾病预后判断研究中，Chen 等[18]基于靶向代谢组学技术，研究了400 名急性髓性白血病（AML）患者和446 名健康对照的不同葡萄糖代谢特征，揭示葡萄糖代谢相关血清代谢物标志物乳酸、2-氧戊二酸盐、丙酮酸、2-HG、甘油-3-磷酸、柠檬酸盐可用于AML 患者的预后判断。在药物靶点开发研究中，Zhang 等[19]在4 个中心的2324 份临床血浆样本非靶向代谢组学研究的基础上，发现冠心病进展相关的代谢标志物N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)，可作为信号分子激活了Rho-ROCK 通路从而触发了RhoA 和Cdc42依赖性心肌损伤，证实沉默神经氨酸酶-1可有效缓解心肌缺血损伤，为冠心病药物研发提供了新的靶点。在中医药研究领域，Zhang 等[20]使用中医方证代谢组学策略，系统地评估生脉散在治疗阿尔茨海默病（AD）转基因模型APPswe/PS1dE9（APP/PS1）的疗效，从代谢层面阐明生脉散对APP/PS1 小鼠的治疗作用，为揭示中医药治疗阿尔茨海默病的机制提供了指导。

表1 代谢组学在胃癌研究中的应用文献检索结果

三 代谢组学在胃癌诊断及预后判断中的应用

在本文中，作者采用6 个关键字“胃癌/胃肿瘤”、“代谢组学”、“诊断”、“预后”、“蛋白质组学”、“基因组学”，检索中国知网（CNKI）、Pubmed 过去10 年代谢组学技术应用于胃癌研究的文献，检索结果（见表1）。综述了近10年来代谢组学技术用于胃癌临床病人、动物和细胞模型的研究，并重点总结生物标志物在胃癌癌症诊断及预后判断中的应用。此外，对使用的技术、样本类型及样本量、统计分析方法等信息进行了汇总(表2)。

四 多组学联用在胃癌诊断及预后判断中的应用

胃癌发病机制复杂，代谢组学单个技术的使用往往不能发现其全部生物学信息的复杂性，将代谢组学与基因组学、蛋白质组学、转录组学相结合，并进行联合分析[49，50]，对胃癌的发生发展进行全面解读，显得尤为必要。Liu 等[47]采用代谢组学联合诊断，对80 例胃癌患者和82 例健康志愿者进行血清MicroRNA 检测、GC/MS代谢组学分析以及血清CEA、CA199含量检测，结果表明5 个microRNAs 在胃癌患者中有有显著性差异表达，MiR-19a和miR-92a的组合，曲线下最高面积（AUC）为0.850，灵敏度为91.3%，特异性为61.0%；GC/MS 分析具有良好的诊断价值，AUC 达到1.0；Cao等[48]采用GC-TOF/MS、RT-PCR 联用分析方法，发现miR-379 中的rs61991156 通过作用于PKM2 的3 UTR区域参与胃癌的发生；临床资料分析显示rs187960998中的A ＞G 与较好的分化，较小的肿瘤体积，无转移相关；miR-379 中的A ＞G SNP 可降低胃癌细胞的增殖以及PKM2 的启动子活性和表达；经代谢组学分析，miR-379 GG 基因型患者糖酵解明显低于AG 和AA 基因型。AA 基因型患者PKM2 表达明显低于G 载体，但miR-379表达无显著性差异；AA基因型患者的生存率明显低于G 型携带者。Song Y 等[51]研究了长链非编码RNA (lncRNAs)，报道了赖氨酸琥珀酰化的定性和定量方法，发现了一种新的机制，通过其核心酶的赖氨酸琥珀酰化，可以调控TCA 循环和戊糖磷酸途径；然后检测了赖氨酸琥珀酰化作为胃癌生物标志物的潜力，并成功地开发了一种琥珀酰化依赖性抗体，用于Caldesmon的K569位点；最后，研究了赖氨酸琥珀酰组与lncRNA 之间的关系，确定了两个lncRNA 和一个琥珀酰化位点之间的潜在交叉位点。这些结果拓展了我们对肿瘤发生机制的认识，为胃癌的诊断和预后提供了新的思路和方法。

表2 代谢组学在胃癌诊断及预后判断中的应用

续表2

续表2

五 讨论

胃癌的发生、发展是一个渐进的过程，通过代谢产物谱的研究，在这个过程中已经发现许多代谢产物的异常表达。本文对近10 年胃癌代谢组学相关文献进行整理，发现氨基酸、脂肪酸、磷脂酰胆碱、肉碱等生物标志物对胃癌的早期诊断可能具有重要意义，其中支链氨基酸(亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸)，谷氨酰胺、精氨酸、鸟氨酸、组氨酸、色氨酸、苯乙酰谷氨酸等在胃癌早期预测中有重要意义。但由于代谢组学本身的复杂性，目前仍处于不断发展和逐步完善的阶段，代谢组学在胃癌诊断标志物研究中仍存在一些需要注意的问题。首先，因为代谢物的变化性和不稳定性，代谢组学对样本的数量和质量要求较高，因此样本数量的增大、肿瘤患者样本采样标准的统一显得尤为重要；其次代谢组学数据复杂多样，因此应用化学计量学与计算机生物学的融合、构建全数据代谢网络和代谢组动态校正定量数学建模是代谢组学工作者需要进一步完成的课题；另外，寻找代谢物中独特的生物标志物是研究热点，但寻找标志物并不是代谢组学研究的终极目标，深入挖掘其作用机理，解释生物标志物与疾病发生发展之间存在的联系通路是研究热点，也是难点。代谢组学虽然已经能在一定程度上进行生物学解释，但在检测过程中很容易受到背景干扰，有时无法完整解释生物学过程，因此需要多组学方法的综合运用[52]，以获得更全面的结果，同时，代谢组学的发展应以临床为导向，结合临床实验和动物实验结果，联系患者疾病表型与机体内在实质变化，缩短基础研究与临床治疗的转化进程，发现具有临床价值的肿瘤标志物[53]。未来，随着代谢组学、基因组学和蛋白质组学等新兴技术的发展和完善，有望筛选出敏感性高、特异性强的胃癌诊断标志物或联合多种标志物用于胃癌的诊断与预后判断。