参芪蛭龙汤对膜性肾病大鼠血清中IL-2、IL-6和TNF-α水平的影响

薛丕良，李凤金，白茹，刘欣欣，袁茵，肖洪彬，牛雯颖*

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江省中医药科学院，黑龙江 哈尔滨 150036)

膜性肾病是血清特异性抗体与足细胞表达的自身抗原结合引发的自身免疫性疾病，上皮下出现免疫复合物沉积和补体激活导致肾小球滤过屏障功能障碍和蛋白尿形成。胸腺和脾脏是人体重要的免疫器官，白介素-2(IL-2)、白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是胸腺基质细胞分泌的细胞因子，这些细胞因子通过与胸腺细胞表面相应受体结合，调节胸腺细胞的发育，促进T细胞的分化成熟。本实验主要观察大鼠血清中IL-2、IL-6、TNF-α的表达水平以及胸腺和脾脏指数。探讨参芪蛭龙汤的作用机制及IL-2、IL-6和TNF-α与膜性肾病发病的关系。

1 材料

1.1 主要仪器

全自动酶标仪(美国Bio-Rad公司，型号：iMarkTM)；日立透射电子显微镜(上海铸金分析仪器有限公司，型号：H-7650)。

1.2 药物及试剂

参芪蛭龙汤(组方:党参、黄芪、当归、川芎、水蛭、地龙、僵蚕、虎杖、淫羊藿和凤尾草，中药饮片购于黑龙江中医药大学附属第一医院)；大鼠白介素(IL-2)检测试剂盒、白介素(IL-6)检测试剂盒、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所有限公司，批号：20180702)。

1.3 动物

清洁级Wistar大鼠40只，雌雄各半，体质量(228±19)g。由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号:SCXK(黑)2008-004。

2 方法

2.1 药物制备

参芪蛭龙汤由党参20 g，黄芪30 g，当归15 g，川芎15 g,水蛭5 g(研末冲服),地龙20 g，僵蚕15 g，虎杖15 g，淫羊藿30 g和凤尾草15 g组成。以上10味，加12倍量水浸泡1 h，煎煮1 h后，滤过。药渣再加10倍量水煎煮1 h，滤过。合并2次滤液，60℃浓缩成1∶1的药液，储存备用。

2.2 阳离子化牛血清白蛋白(C-BSA)制备

参照Border法[1]，取67 mL无水乙二胺(EDA)液，加入500 mL双蒸水，再加入6 mol/L盐酸350 mL，调整pH值到4.75，冷却至25℃，进行搅绊，再加入天然牛血清白蛋白(N-BSA)5 g溶于25 mL重蒸馏水的溶液，搅拌完全后再加1.8 g炭化二亚胺盐酸盐(EDCHCL)维持25℃，持续搅拌2 h，保持pH值4.75，最后加入4 mol/L(pH值4.75)的醋酸缓冲液30 mL，终止反应，即得到等电点提高的C-BSA溶液。将C-BSA溶液置于透析袋中，用4℃的双蒸水透析72 h(3～5 h换水1次)，冷冻干燥后，即得BSA干粉。用聚丙烯酰胺等测定其等电点(PI)，PI>8.5即可。C-BSA保存于-40℃备用。

2.3 膜性肾病大鼠模型复制

取Wistar大鼠40只，适应性饲养1周后，将大鼠置于代谢笼中，接24 h尿液，测尿蛋白含量。

预免疫：对尿蛋白阴性的大鼠，留出10只作空白对照，对其余大鼠进行预免疫。将80 mg C-BSA溶于15 mL PBS中，与等量弗氏不完全佐剂混合，超声乳化完全后进行预免疫。除空白对照组外，于每只大鼠腹股沟、腋窝等处进行多点皮下注射，每只0.3 mL 的乳化物，每点注射不超过0.05 mL。正常对照组则以PBS与弗氏不完全佐剂按上述比例乳化后进行皮下注射。1周后，进行正式免疫(制作模型)：每次将C-BSA溶于1 mL PBS中进行尾静脉注射，首次C-BSA尾静脉注射量为3.5 mg/只，隔日1次，每周3次，6周内缓慢将注射量递增至5 mg/只，正常对照组注射同体积的PBS。6周后留取动物24 h尿液，测尿蛋白含量。

2.4 分组给药

将造模成功的30只大鼠按照尿蛋白数值随机分为参芪蛭龙汤低剂量组、高剂量组和模型组，每组10只。参芪蛭龙汤组灌胃给药剂量为4 g生药/kg和8 g生药/kg。空白组和模型组大鼠灌胃给予等体积的蒸馏水。在造模2周后开始给予中药汤剂早晚各1次，连续给药4周。

2.5 检测指标

2.5.1 血清中IL-2、IL-6、TNF-α的水平

采用IL-2、IL-6、TNF-α测试盒，用双抗夹心酶联免疫吸附(ELISA)方法检测大鼠血清中IL-2、IL-6、TNF-α的水平。

2.5.2 胸腺和脾脏指数

称大鼠体质量后，采用5%水合氯醛腹腔注射麻醉，取大鼠胸腺和脾脏，称内脏重量；计算出脏器指数(内脏)。

脏器指数(%)= 脾脏或胸腺质量(mg)/大鼠体质量(g)×100%

2.5.3 电镜观察大鼠肾组织病理形态

电镜标本(取1 mm×1 mm×1 mm大小肾皮质)采用2.5%戊二醛固定液固定，乙醇梯度脱水，环氧树脂包埋切片，醋酸铀、柠檬酸铅双重染色，透射电镜下观察。

2.6 统计方法

3 结果

3.1 对膜性肾病大鼠体质量的影响

由表1可见，造模前，各组大鼠间体质量无显著性差异(P>0.05)。与空白组比较，模型组大鼠给药后体质量显著降低(P<0.01),而参芪蛭龙汤组大鼠体质量有升高趋势，但与模型组比较，无显著差异性(P>0.05)。

表1 参芪蛭龙汤对膜性肾病大鼠体质量的影响比较

注：与空白组比较，**P<0.01。

3.2 对膜性肾病大鼠胸腺和脾脏重量及指数的影响

由表2可见，与空白组比较，模型组大鼠脾脏重量、脾脏指数和胸腺指数均显著升高(P<0.01)，而胸腺重量有升高趋势，但无显著性差异(P>0.05)。与模型组比较，参芪蛭龙汤高剂量组可显著降低膜性肾病大鼠脾脏重量、胸腺指数、脾脏指数(P<0.01,P<0.05)，而对胸腺重量有降低趋势，但无显著性差异(P>0.05)。

3.3 对膜性肾病大鼠血清IL-2、IL-6和TNF-α含量的影响

由表3可见，与空白组比较，模型组大鼠血清中IL-2含量显著降低(P<0.01)；TNF-α含量显著升高(P<0.05)。与模型组比较，参芪蛭龙汤低剂量和高剂量组IL-2含量均显著升高(P<0.05或P<0.01)；参芪蛭龙汤低剂量组TNF-α含量呈下降趋势(P>0.05)，参芪蛭龙汤高剂量组TNF-α含量显著降低(P<0.05)；与模型组比较，空白组、参芪蛭龙汤低剂量组和高剂量组中IL-6含量均无显著性变化(P>0.05)。

表2 参芪蛭龙汤对膜性肾病大鼠胸腺和脾脏重量和指数影响的比较

注：与模型组比较,**P<0.01，*P<0.05;与空白组比较，#P<0.01。

表3 参芪蛭龙汤对膜性肾病大鼠血清中IL-2、IL-6和TNF-α含量影响的比较

注：与空白组比较,#P<0.01，△P<0.05;与模型组比较，**P<0.01,*P<0.05。

3.4 对膜性肾病大鼠肾脏病理变化的影响

由图1所示，空白组大鼠肾脏组织中肾小球足细胞结构清晰、足突无融合、基底膜均匀、无增厚、上皮下无电子致密物形成。模型组大鼠肾脏组织中肾小球足突广泛融合或消失、微绒毛形成、基底膜弥漫重度增厚、上皮下大量大块电子致密物沉积，电子致密物周围大量基底膜增生。参芪蛭龙汤低剂量组肾脏组织中肾小球足突广泛融合、基底膜弥漫轻度增厚，少量电子致密物沉积。参芪蛭龙汤高剂量组足突弥漫融合，基底膜仅部分增厚，极少电子致密物沉积。

图1 参芪蛭龙汤对膜性肾病大鼠肾组织病理形态的影响(20 000×)

4 讨论

参芪蛭龙汤是在广泛查阅文献，总结历代医家经验的基础上，反复遴选，精简药味而成，应用临床多年，疗效确切。膜性肾病以脾肾亏虚为本，湿浊瘀血为标。方中党参、黄芪补益脾气,淫羊藿补益肾阳、鼓舞肾气，为君药；当归、川芎活血化瘀，水蛭、地龙、僵蚕虫类入络，化瘀消癥为臣药；虎杖、凤尾草活血化瘀、利水消肿为佐药；全方共奏补益脾肾、化瘀利湿之效。黄芪具有降低血液高黏度状态，控制炎症反应，增强机体免疫功能[1]。水蛭中含有水蛭素、肝素和抗血栓素成分，具有抗凝、降低血液黏稠度等作用，可改善肾病综合征高脂高凝状态[2]。当归可以降低血小板聚集、降低血脂，保护肝脏、利尿、抗炎、抗氧化和清除自由基、抗组织纤维化、改善肾脏组织的血流灌注从而减轻肾组织的缺氧性损伤[3-4]。党参能调节机体的细胞免疫和体液免疫功能，使巨噬细胞数量增加，提高网状内皮细胞吞噬能力[5]。虎杖苷可通过抑制肾组织中Toll样受体4(TLR4)、髓样分化因子(Myd88)、核转录因子KappaB(NF-КB)的表达，抑制其下游通路炎症因子IL-6，TNF-α的生成，减少炎症因子对肾组织的攻击损害[6]。

特发性膜性肾病病理特点是电镜下肾小球基底膜弥漫性增厚，上皮下电子致密物沉积。这些沉积于上皮下的免疫复合物来源于循环中自身抗体与表达于足细胞上的内源性抗原的结合[7]，上皮下免疫复合物沉积和补体激活导致肾小球滤过屏障功能障碍和蛋白尿形成。细胞因子是由免疫原、丝裂原或其他因子刺激细胞所产生的低分子量可溶性蛋白质，具有调节固有免疫和适应性免疫应答的作用。IL-2具有活化T细胞并促进其增殖的作用，IL-6可促进B细胞的活化、增殖和分化为抗体产生细胞，TNF-α通过促使炎症细胞因子的合成与释放,促进细胞黏附分子的表达、以及促进前列腺素E2血小板活化因子的合成与释放,使炎症细胞聚集与黏附、微血管扩张与通透性增加[8]。TNF-α多由T细胞与单核/巨噬细胞产生，在肾脏疾病发病中发挥着重要作用的炎症介质，一方面可对组织细胞直接作用，另一方面也会诱发其他类型的炎症介质间接地发挥作用[9]。

本研究中发现，与正常组大鼠比较，膜性肾病大鼠血清中IL-2含量显著下降。参芪蛭龙汤治疗后血清中IL-2含量显著升高(P<0.05)。实验研究膜性肾病大鼠血清IL-2水平降低，可能与该病免疫力低下有关。IL-6是参与免疫调节和炎症反应的重要细胞因子，正常肾脏细胞产生微量的IL-6，当肾小球细胞或系膜受到TNF-α刺激后，IL-6分泌可增加，IL-6与细胞膜上的受体结合刺激肾小球系膜细胞增殖。因而TNF-α和IL-6与增殖性肾小球疾病的发生、发展密切相关[9]。本研究中模型组TNF-α水平显著升高，与空白组相比有统计学差异(P<0.05)。经参芪蛭龙汤治疗后，与模型组比较，中药高剂量组TNF-α水平明显下降(P<0.05)，中药低剂量组TNF-α水平呈下降趋势，但无统计学差异(P>0.05)。空白组、模型组、中药高低剂量组IL-6水平均无显著差异。结合其他的研究成果发现,PNS可能与炎症因子 TNF-α、IL-6 升高有关[10-11]。

肾病综合征根据病理类型分为微小病变肾病、系膜增生性肾炎、局灶节段性肾小球硬化、膜型肾病和系膜毛细血管性肾小球肾炎。以往对IL-2、IL-6、TNF-α等细胞因子在肾病综合征发病中作用的实验研究均未明确进行病理分型，所以出现不同的实验结果，甚至有些实验结果完全相反。本实验研究针对膜性肾病大鼠进行研究发现，膜性肾病大鼠IL-2水平下降、TNF-α水平升高，IL-6水平未见明显变化，提示不同病理类型的肾病综合征，其发病参与的炎症因子不同，IL-6未参与膜性肾病的发病。有实验研究表明,IL-6作为肾脏系膜细胞的一种自分泌生长因子,能够促进肾脏系膜细胞增多和基质增生，且与之呈正相关[12]。膜性肾病系膜细胞和基质均正常，也说明IL-6未参与膜性肾病的发病。系膜增生性肾炎、局灶节段性肾小球硬化、系膜毛细血管性肾小球肾炎系膜细胞和基质均有不同增生，结合以往实验研究发现，IL-6可能参与系膜增生性肾炎、局灶节段性肾小球硬化、系膜毛细血管性肾小球肾炎的发病。Horii等[13]研究表明，微小病变肾病(MCNS)和正常人尿中无IL-6活性，可能IL-6未参与微小病变型肾病的发病。

本次实验研究表明,参芪蛭龙汤能升高膜性肾病大鼠血清IL-2水平，降低TNF-α水平，提示IL-2和TNF-α可能参与大鼠膜性肾病的发病，IL-6与大鼠膜性肾病发病无关。膜性肾病胸腺和脾脏指数增大，提示存在异常免疫功能亢进。