响应面法优化地骨皮多糖提取工艺

刘 涛，王 清，夏新奎，梁丽丽

(信阳农林学院 食品学院，河南 信阳 464000)

地骨皮是枸杞的根皮，枸杞生命力顽强，对土壤要求不严，可以在干旱、盐碱地生长，但不宜在沼泽地生长,大多分布在我国华北、东北地区[1-2]。地骨皮的形态特征为：干燥的根皮呈短小的筒状或槽状卷片，表皮大多为灰黄色或棕黄色，有裂纹。地骨皮中主要包括有机酸类、黄酮类、酚类、多糖类等化学物质[3-4]，常作为中药药材，性寒、味甘,具有降血压，降血脂，清肺降火，保肝护肝等功效，如果能将地骨皮应用到食品中，将会对人体健康大有裨益。

多糖是由多个单糖分子缩合、失水，通过糖苷键组成的碳水化合物，在自然界分布极广，具有免疫调节、抗病毒、抗癌、延缓衰老、降血压、降血脂、美容等许多生物功能。由于多糖是从生物体中提取，所以对人体的毒副作用小，多糖的应用领域越来越广[5-7]。目前从中草药中提取多糖已成为研究热点，但对地骨皮多糖的提取和研究还很少。本文主要研究地骨皮多糖的提取，以便为地骨皮多糖的深入研究打下基础。

1 材料与仪器

材料：地骨皮在信阳中药店购买，经信阳农林学院中药教研室鉴定为中药地骨皮。

试剂：葡萄糖，浓硫酸，苯酚，都为国产分析纯。

仪器: TU-1810型紫外线分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)，WK-4008高速药物粉碎机(青州市(山东)精诚机械有限公司)，LDZ4-0.8型离心机(北京医用离心机厂)，数显提取恒温锅(北京精科华瑞仪器有限公司)，分析天平(国产)。

2 试验方法

2.1 多糖的提取工艺

地骨皮粉碎—热水浸提—高速离心取上清液—减压浓缩—加入5倍无水乙醇沉淀—加入丙酮、乙醚沉淀—干燥获得地骨皮多糖[8]。

2.2 标准曲线绘制(硫酸-苯酚法)

标准曲线的回归方程为K=5.3788c+0.0011，R2=0.9993，K是吸光度值，c为样品的浓度。

2.3 单因素试验

2.3.1 提取时间对地骨多糖提取率的影响

称取一定量粉碎后的地骨皮，在料液比、温度相同的条件下，设置不同的时间梯度热水浸提，离心后取上清液，然后测量不同时间下溶液的吸光度值。

2.3.2 提取温度对地骨皮多糖提取率的影响

称取一定量粉碎后的地骨皮，在时间、料液比相同的条件下，设置不同的温度梯度后热水浸提，离心后取上清液，然后测量不同温度下的溶液吸光度值。

2.3.3 液料比对地骨皮多糖提取率的影响

称取一定量粉碎后的地骨皮，在温度、时间相同的条件下，设置不同的液料比后热水浸提，离心后取上清液，然后测量不同料液比条件下溶液的吸光度值。

2.4 提取率的计算

样品溶液的吸光度值通过标准曲线换算可获得对应提取物的浓度，因此多糖提取率可按下面的公式计算：

2.5 响应面试验

在单因素优化的基础上，设计优化地骨皮多糖提取率的响应面试验。依据Box-Benhnken试验设计原理[9-10]，通过建立多元二次回归模型方程，用多项式对本试验中各个因素与指标的相互关系进行近似拟合，通过对回归方程的分析及各因素交互作用的响应面图形分析来寻求最优工艺参数。

3 结果与分析

3.1 单因素试验

3.1.1 提取时间对地骨皮多糖提取率的影响

分别称取5份3.0000 g地骨皮，加入90 mL蒸馏水，70 ℃水浴恒温条件下分别加热1.5、2、2.5、3、3.5 h。每份溶液浸提后离心10 min(10 000 r/min)取上清液测量吸光度值。试验结果如图1所示。

图1 时间对地骨多糖提取率的影响

由图1可知，在提取温度、料液比一定的条件下，当提取时间为2.5 h时,地骨皮多糖的提取率达到最高点。在1.5～2.5 h过程中，随着提取时间的延长，多糖的提取率增加。当提取时间大于2.5 h后多糖提取率呈下降趋势，原因可能是随着时间延长多糖发生一定程度的分解[11]，从而使多糖的提取率下降。

3.1.2 提取温度对地骨皮多糖提取率的影响

分别称取5份3.0000 g地骨皮，加入90 mL蒸馏水，提取时间设置为2.5 h，分别在50、60、70、80、90 ℃下水浴恒温加热。每份溶液浸提后离心10 min(10 000 r/min)取上清液测量溶液的吸光度值。试验结果如图2所示。

由图2可知，在提取时间、料液比一定的条件下，当提取温度为70 ℃时，地骨多糖的提取率达到最高点。在50～70 ℃的过程中随着提取温度升高，多糖的提取率增加。当温度大于70 ℃后多糖提取率呈下降趋势。原因是温度过高可导致多糖分解，随着温度的升高多糖的稳定性降低[12]，从而使地骨皮多糖的提取率降低。

图2 提取温度对地骨皮多糖提取率的影响

3.1.3 液料比对地骨皮多糖提取率的影响

分别称取5份3.0000 g地骨皮，加入90 mL蒸馏水。设置提取温度为70 ℃，提取时间为2.5 h。液料比分别按15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1、35 ∶1 mL·g-1水浴恒温浸提后，离心10 min后(10 000 r/min)取上清液测量其吸光度值，试验结果如图3所示。

图3 液料比对地骨多糖提取率的影响

如图3所示，在温度、时间一定的条件下，液料比为25 ∶1 mL/g左右时地骨多糖的提取率达到最高点。当液料比在15 ∶1 mL/g到25 ∶1 mL/g的过程中提取率呈上升趋势，因为随着液料比的增加，物料溶解的程度越来越大，物料溶解的程度越大，多糖的提取率也越大。当液料比大于25 ∶1 mL/g时提取率呈平稳趋势，这表明液料比为25 ∶1 mL/g时多糖已经基本提取完全。

3.2 响应面优化地骨皮多糖提取工艺

3.2.1 分析因素的选择及分析方案

根据单因素地骨皮多糖提取工艺参数，可确定3个因素和3个水平进行地骨多糖提取响应曲面试验设计(见表1)。响应曲面试验数据设计见表2。

表1 响应面分析因素与水平表

表2 试验方案及试验结果

3.2.2 模拟方程的建立

使用Design expert 8.0.6.0软件对表2中地骨皮多糖提取率多元回归拟合，得回归方程为

K=16.78-1.13A+0.57B-0.078C+0.35AB-

0.67AC-1.23BC-1.88A2-2.52B2-3.23C2

式中:K为地骨多糖的提取率(%);A表示提取温度(℃)；B表示提取时间(h);C表示液料比(mL/g)。

3.2.3 方差分析

为了检验回归方程是否有效，确定各因素对地骨皮多糖提取率的影响程度，对回归方程进行方差分析,如表3所示。

方程的二次项系数为负，说明存在最大值。

表3 响应面回归方程的方差分析

注:*表示显著(P<0.05)；**表示极显著(P<0.01)。

3.2.4 交互因素分析

两两因素交互作用对地骨皮多糖提取率影响的响应面3D图如图4、图5、图6所示。

图4 液料比和提取温度对地骨皮多糖提取率的影响

由图4可知，提取温度和液料比的交互作用构成的响应面图有最高点。多糖的提取率随着提取温度和液料比值的变大先增加后减小。由曲面陡峭程度和P值可知液料比比提取温度对多糖提取率的影响程度大。

由图5可知，在一定范围内当液料比和提取时间同时增加时，地骨皮多糖的提取率也在增加。当液料比达到25 ∶1左右和提取时间达到2.5 h左右时，地骨皮多糖的提取率达到最大。当液料比大于25 ∶1，提取时间大于2.5 h时，随着液料比和时间的增加，地骨皮多糖的提取率下降。由图5曲线坡度的陡峭程度和表3的P值可知，液料比比提取时间对地骨皮多糖的提取率影响程度大。

图5 时间和料液比对地骨皮多糖提取率的影响

图6 时间和温度对多糖提取率的影响

由6可知提取时间和提取温度构成的响应面图有最高点，即两者有交互作用。多糖的提取率随着提取时间和提取温度值的变大先增加后减小，但由曲面的陡峭程度和表3的P值可以看出，提取温度比提取时间对地骨皮多糖提取率的影响显著。

3.2.5 试验的验证

通过Design Expert8.0.6.0分析得到模型的极大值点为：液料比23.55 ∶1 mL/g、提取温度70.91 ℃、提取时间2.5 h。最佳提取率为 16.9661%。为了验证试验方案的有效性，设计了3组平行试验，考虑到实际操作取液料比24 ∶1 mL/g、提取时间2.5 h、提取温度71 ℃，由3组平行试验数据取平均值得提取率为16.9020%。实际值与理论值相差0.38%，误差较小。所以通过Design expert 8.0.6.0软件得到的骨皮多糖提取率的回归方程有效，具有参考价值。

4 结论

由单因素试验和响应面试验的结果可知，地骨皮多糖提取工艺的最佳条件为液料比是23.55 ∶1 mL/g、提取温度为70.91 ℃、提取时间是2.5 h。最佳提取率为16.9661%。考虑到实际操作，取液料比24 ∶1 mL/g、提取时间2.5 h、温度取71 ℃，由试验验证得提取率为16.9020%，多糖提取率实际值比理论值小0.38%，所以响应面法优化地骨皮多糖提取率工艺参数可靠有效。由方差分析得液料比的P值小于0.000 1，提取温度的P值0.003，提取时间的P值0.5674。即这3个因素对地骨皮多糖提取率的影响程度为液料比最大，提取时间影响程度最小，提取温度介于两者之间。