应用噬菌体治疗畜禽细菌性腹泻的研究进展

王通，李晓宇,2,4，王丽丽,2,4，李淑英，徐永平.*

(1 大连理工大学生物工程学院, 大连 116024；2 动物性食品安全保障技术教育部工程研究中心, 大连 116600；3 大连赛姆生物工程技术公司, 大连 116620；4 辽宁省大连赛姆噬菌体应用工程技术研究中心，大连 116600)

1 引言

养殖业的发展关系到每个人的饮食安全与身体健康。在我国，规模化养殖已成为畜禽养殖的最主要形式，这也增加了畜禽疾病传播的风险。其中，细菌性疾病是影响养殖业发展的主要问题之一，每年投入人力、药物等成本巨大，为养殖户带来了沉重的负担。

畜禽腹泻是养殖过程中的一种常见病症，通常与肠道疾病或其他全身性疾病相关。除肠道细菌感染造成的腹泻之外，常见病因还有动物中毒、寄生虫感染、营养问题、应激及神经性因素等。治疗畜禽腹泻要对症下药，根据病因找到最合适的治疗方法。其中由大肠埃希菌(Escherichia coli)、沙门菌(Salmonella)等病原菌造成肠道疾病引起的腹泻最为常见[1]。养殖过程中饲料加工、笼舍清理、温度调节等方面处理不当都可为病菌传播提供条件。动物染病后发生腹泻常伴有食欲不振、生长缓慢等问题，严重时可导致死亡。疾病传播可导致减产，对畜牧业发展造成严重影响。常用的抗生素疗法存在药物残留、致病菌出现耐药性等诸多弊端，因此找到一种合适的替代疗法已经迫在眉睫[2]。噬菌体疗法凭借无残留、成本低等多方面优势成为一种潜在的替代选择，本文就噬菌体防治畜禽腹泻研究现状进行了综述。

2 噬菌体简介

噬菌体(bacteriophage)于1915年由英国细菌学家Twort (1877-1950)和加拿大生物学家Félix d'Herelle发现，是对一类能感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称[3]。噬菌体能特异性结合、裂解宿主，根据噬菌体与宿主的关系，可将其分为温和噬菌体和裂解性噬菌体两大类。裂解性噬菌体增殖周期短，每次裂解宿主都可产生多达200个子代噬菌体，具有极高的增殖效率[4]。利用这种裂解效应来特异性杀灭病原菌，具有极高的精确性，治疗效果也十分显著[5]。一般而言，致病菌对噬菌体的抗性突变率很低，频率约为10-7，而对抗生素的抗性突变频率为10-6，噬菌体可以在病原菌产生抗性之前将其有效杀灭。此外，噬菌体疗法不存在药物残留问题，也不会污染畜禽产品[6]。凭借其多方面优势，噬菌体成为一种抗生素理想的替代品。

3 噬菌体治疗畜禽腹泻

3.1 防治大肠埃希菌引起的腹泻

大肠埃希菌属革兰阴性细菌，广泛分布于人畜的肠道环境里。多数大肠埃希菌是非致病性的，但部分致病性大肠埃希菌能够引起肠道内外部感染。致病性大肠埃希菌是一类常见的、能够引起畜禽肠道疾病的病原菌。研究人员根据致病机理的不同将致泻性大肠埃希菌主要分为6类：产肠毒性大肠埃希菌(EnterotoxigenicE.coli, ETEC)、肠出血性大肠埃希菌(EnteropathogenicE.coli, EHEC)、肠粘附性大肠埃希菌(EnteroadhesiveE.coli, EAEC)、肠致病性大肠埃希菌(EnteropathogenicE.coli, EPEC)、肠侵袭性大肠埃希菌(EnteroinvasiveE.coli, EIEC)和扩散粘附性大肠埃希菌(Diffusely adherent E.coli, DAEC)。作者所在团队(付丽娜，2017)对于各类致病性的大肠埃希菌的噬菌体治疗进行过研究[7]，并成功分离出了猪源肠产毒性大肠埃希菌噬菌体。牛羊等反刍动物是食源性大肠埃希菌感染的重灾区，而幼年动物比成年动物更易受到感染。幼畜中最常见的大肠埃希菌病是由非侵入性肠毒素大肠埃希菌(ETEC)引起的，也是腹泻的主要原因之一。患病严重时会伴有出血性腹泻等症状，是导致幼畜死亡的主要威胁之一。

国内外对利用噬菌体治疗致病性大肠埃希菌引起的畜禽肠道疾病都进行了广泛的研究，作者所在团队(牛冬燕，2009)对应用噬菌体控制牛及其饲养环境中大肠埃希菌O157:H7进行充分研究，利用wV7、wV8、rV5和wV11共四种噬菌体对牛场中大肠埃希菌O157:H7进行裂解，研究表明，口服给药的四株噬菌体可以有效裂解大部分受检菌株，不同饲养场的菌株对噬菌体wV8表现出不同的易感性，发现噬菌体rV5、wV11和wV8的易感性受其噬菌体表型和PFGE基因型影响，而噬菌体wV7的宿主谱和裂解能力不受菌株的噬菌体表型和PFGE基因型的影响，能够有效地裂解所有受检分离株[8]。Callaway等[9]从饲育场的环境中筛选得到了针对大肠埃希菌O157:H7的噬菌体，利用其治疗绵羊的大肠埃希菌感染，24h后发现羊体内和粪便中的大肠埃希菌数量显著下降。Cha等[10]检测特异性噬菌体CJ12治疗ETEC感染的效果，他们将噬菌体混入猪饲料中给药，两个实验组的猪粪便中的ETEC数量减少了63.92%和60.73%。Rozema等[11]分别通过口服和注射给药的方式利用噬菌体治疗大肠埃希菌O157，都取得了良好的治疗效果。Denou等[12]利用T4噬菌体对感染大肠埃希菌O157:H7的小鼠进行试验，治疗效果过十分显著，且未造成任何不良反应。Li等[13]利用噬菌体治疗大肠埃希菌造成的腹泻，将大肠埃希菌接种到小鼠体内，经噬菌体治疗三周后，所有小鼠全部存活。利用噬菌体治疗染病的肉鸡，显著的降低了肉鸡的死亡率，且肉鸡增重明显。饲料的利用率提高了11%，饲料的消耗量也大幅降低。说明在实际生产过程中，利用噬菌体治疗大肠埃希菌引发的肠道疾病，能有效地降低养殖成本。Lau等[14]利用噬菌体EC1治疗大肠埃希菌O78：K80导致的肉鸡腹泻，在三周的试验过后，肉鸡死亡率从83.3%下降至13.3%。Huff等[15]利用噬菌体治疗大肠埃希菌导致的肉鸡腹泻，实验将感染大肠埃希菌后不进行处理的肉鸡与应用噬菌体进行治疗的肉鸡进行对比，结果显示，未经噬菌体治疗的一组肉鸡死亡率高达47%，而应用噬菌体进行治疗的一组，其死亡率降低至13%。证明噬菌体在治疗家禽大肠埃希菌腹泻上效果十分显著。El-Gohary等[16]将噬菌体喷洒到褥草上来抑制大肠埃希菌的扩散，实验结果显示，经过噬菌体处理的肉鸡受大肠埃希菌影响极低，生长迅速，且其食用安全性未受到影响。

3.2 防治沙门菌引起的腹泻

沙门菌是一类常见的革兰阴性菌，在自然界中分布十分广泛，营养需求较低，种类繁多，目前已检测出沙门菌血清型2500余种[17]。沙门菌作为一类常见的食源性致病菌，通常能够诱发肠道疾病，养殖业中主要感染对象为家禽，除造成畜禽患病以外，还可能通过污染动物制品感染人类，严重时可导致食物中毒。家禽感染后，种蛋的孵化率、育雏率和成活率会都受到严重影响，给养殖户带来巨大的经济损失。

常见的沙门菌病有鸡白痢、鸡伤寒和鸡副伤寒等。其中最为常见的是鸡白痢，鸡白痢是雏鸡的一种急性、败血性传染病[18]。2周龄以内的雏鸡发病率和死亡率都很高，成年鸡感染沙门菌则多表现为慢性症状。沙门菌可以进行水平传播也可以进行垂直传播，大多通过带菌种鸡垂直传播给雏鸡，也可以通过粪便水平传播。如果孵化了带菌的鸡蛋，雏鸡出壳1周内就可能发病死亡，对于雏鸡的成活率影响极大。育成期虽有感染，但一般无明显临床症状，种鸡场一旦被污染，很难根除。

研究表明利用噬菌体治疗家禽沙门菌感染导致的腹泻效果十分显著，作者所在团队成员(袁玉玉，2016)[19]曾对应用噬菌体治疗沙门菌导致的鸡白痢进行过研究，分离得到强裂解性噬菌体，通过滴眼和口服方式给药，分组实验中治愈率最高可达80%。Atterbury[20]等研究发现，利用高浓度的噬菌体制剂能有效的减少肉鸡肠道沙门菌和鼠伤寒沙门菌在肉鸡肠道内的数量。且尽管会出现部分噬菌体抗性突变菌，但在体内和体外的实验中均发现其抗性持续时间较短，因而总体上噬菌体治疗效果十分显著。另一项研究表明，向蛋鸡基础日粮中添加针对鸡沙门菌、鸡白痢沙门菌、鼠沙门菌、鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌、德比沙门菌和金黄色葡萄球菌的混合噬菌体。可使蛋鸡盲肠内容物内沙门菌数量直线下降，且未观察到噬菌体作为饲料添加剂对蛋鸡的产蛋性能的不良影响。此外，噬菌体还能减弱种蛋孵化过程中的沙门菌感染[21]。Henriques等[22]向孵化过程中感染沙门菌的蛋壳表面喷洒噬菌体后发现，喷洒组中孵化的雏鸡与未喷洒组中相比关节炎症状明显减轻，且8d后症状消失，与未感染沙门菌种蛋孵化的雏鸡状态相似。这说明噬菌体可以阻断沙门菌的垂直传播。

3.3 治疗途径

噬菌体是替代抗生素的理想选择，而在畜禽大规模养殖过程中，出于成本等多方面考虑，将噬菌体制剂混入饲料中给药是最为常见的方法[23]。研究中发现将噬菌体混入饲料中直接饲喂的治疗效果并不理想，其原因在于通过消化道到达胃肠道过程中，噬菌体可能会受到饲料成分、各类杂质、胃酸等外界条件的影响而导致其活性下降甚至丧失活性[24]。因此，要保证口服噬菌体治疗动物胃肠道疾病的疗效，就必须找到一种能保护噬菌体不受到破坏，在给药过程中保持噬菌体活性的方法[25]。作者所在团队(马永生，2011)开发了一种噬菌体口服微球制剂，利用海藻酸钠、乳清蛋白为载体材料，利用二甲金属阳离子钙为固化剂制成微球制剂能够有效地保护噬菌体免受胃酸和消化酶作用而遭到破坏。使得噬菌体可以到达动物肠道并有效地释放，直达病灶充分发挥作用，保证了噬菌体治疗的快速、高效[26]。Colom等[27]利用脂质体包被噬菌体，治疗家禽沙门菌感染，72h后胶囊化给药的噬菌体在动物体内仍存在38.1%，而未经包被给药的噬菌体，只剩9.5%，其对噬菌体的保护作用突出。Kaikabo等利用壳聚糖制成包被噬菌体的微粒治疗肉鸡大肠埃希菌感染，肉鸡死亡率从58.33% 降低至16.7%，噬菌体的保存率从42%提高至83.33%，充分说明口服给药过程中对噬菌体进行包装加工的重要性。这种新型的噬菌体制剂为噬菌体疗法在畜牧业中的推广应用开辟了的道路。

4 结论与展望

抗生素耐药性已经成为公共卫生领域的世界性问题，开发新抗生素的成本高、周期长等多方面问题都让人们不得不加紧寻找一种合适的替代品[28]。国内外的大量实验证明，利用噬菌体来防治由细菌感染造成的畜禽腹泻是安全有效的[29]。噬菌体在自然界含量丰富，分布广泛。与传统的药品相比，噬菌体的开发周期更短，成本低廉。通过简单的筛选、离心去除细菌碎片即可得到相对纯净的噬菌体储存运输条件宽松，一般常温即可。利用噬菌体治疗疾病的常见方法，除将噬菌体直接作为抗菌剂，也可将噬菌体编码的裂解酶作为抗菌剂以及从噬菌体的裂解机制出发，寻找新的药物靶点，通过多种途径发挥噬菌体的功能，使其效用最大化。噬菌体所具有的高度特异性使其在发挥作用的同时不会对机体内的固有菌群产生影响，也不会干扰机体的正常代谢。相较于抗生素，病菌对噬菌体产生抗药性的几率非常低，因而将噬菌体制剂产业化应用到治疗畜禽腹泻以及其他的常见疾病中潜力十分巨大。根据近年来的经验以及应用方面的成果，越来越多的科学家和企业都相信，噬菌体用于替代抗生素治疗细菌性疾病的应用将会取得巨大的成功。此外，当代生物医学技术发展突飞猛进，各种新的培养检测方法也层出不穷，在此基础上人们对噬菌体的生物学特性以及噬菌体与其宿主菌的相互作用机制也有了更深层的研究，这样更有利于研制出新的噬菌体制剂及为噬菌体治疗提出科学可行的策略，预防和治疗细菌感染。

虽然噬菌体疗法有诸多优势，但在其实际应用过程仍存在诸多不足，例如噬菌体裂解谱过窄、裂解病菌后其释放内毒素等都影响了噬菌体疗法的进一步推广。因而筛选广谱噬菌体、根据实际需要通过基因工程技术对现有噬菌体进行改造成为了其发展的趋势，由于噬菌体是通过其内部含有的多种酶类发挥作用，因此对其所含的酶加以提纯利用也是噬菌体研究发展的趋势之一。随着对噬菌体分子机理层面研究的不断深入，相信在不远的将来，噬菌体疗法会为养殖业乃至人类的健康做出更大的贡献。