硒化牡蛎多糖制备及其抗氧化和抗肿瘤活性研究

丁佳玉，曲 敏，佟长青，李 伟

（大连海洋大学食品科学与工程学院，辽宁大连 116023）

牡蛎别名蛎黄，是一种双壳类软体动物。牡蛎主要生长在温带和热带等沿海水域[1]。在我国牡蛎的分布也很广泛，其养殖范围由北至南，且生长在咸淡水交界处的牡蛎尤为肥美。牡蛎具有良好的营养价值，牡蛎中含有丰富的微量元素、糖原，具有保肝护肝[2]、降血糖、降尿糖[3]等生理活性。

硒是人体生命活动中必需的微量元素之一，经研究表明适当补硒能够延缓衰老、抗氧化、抑制或协同抗肿瘤等[4-5]。根据研究显示，有机硒与无机硒相比能降低其毒性，提供更好的抗氧化、抗肿瘤能力[6-7]。

目前，对于硒化多糖的抗肿瘤活性研究并不多。商龙臣等人[8]用南瓜硒多糖作用于乳腺癌细胞MDA-MB-231，给药48 h后效果最好，抑制率可达到50.3%，较好地抑制了癌细胞的生长。Weili Zhu等人[9]研究何首乌酸性多糖，结果表明何首乌酸性多糖具有很好的抗肿瘤、抗氧化能力，是一种潜在的抗氧化剂、抗肿瘤药物。Fei Liu等人[10]研究硒化后的蛹虫草多糖抑制肝癌细胞，分离后的硒化蛹虫草多糖对肝癌细胞具有一定的抑制作用。Hui-Li Chu等人[11]发现马尾松（Pinus massoniana）花粉硫酸化多糖（SPPM60） 在HepG2细胞G2/M期对其具有抑制作用，并且抑制率与药物浓度呈依赖性。Guowei Ya[12]发现纯化的香菇多糖通过线粒体通路可有效诱导HeLa细胞凋亡。

硒与牡蛎多糖经过化学反应，使所得多糖中含有Se=C键或Se-O，从而形成有机硒化合物——牡蛎硒多糖，实现牡蛎多糖硒化。研究硒化牡蛎多糖清除DPPH·，ABTS+，·OH清除率及铁还原力等体外抗氧化活性，以及对人宫颈癌和肝癌细胞的抑制作用，通过流式细胞术检测并探讨抑制肿瘤细胞的机制，为牡蛎深加工及产业化提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牡蛎多糖干粉（实验室自制）；氯仿、正丁醇、亚硒酸钠、乙醇、高氯酸、浓盐酸、浓硝酸、硒标准、邻苯二胺、柠檬酸、氢氧化钠、磷酸氢二钠、DPPH·、抗坏血酸、ABTS+、K2S2O8、无水乙醇、FeSO4、水杨酸、30%H2O2溶液等，均为分析纯；甲醇色谱纯；DMSO（细胞级）、1640培养基、MEM培养基、胰蛋白酶、四甲基偶氮唑盐（MTT）、青链霉素混合液、PI染液和RNase A，北京索莱宝科技有限公司提供；胎牛血清，杭州四季青生物工程有限公司提供；人宫颈癌细胞株（Hela）、人肝癌细胞株（HepG2），中科院上海细胞所提供。

1.2 仪器与设备

立式冷冻离心机，盐城市安信实验仪器有限公司产品；PB-10型Sartorius精密pH计，上海精密科学仪器有限公司产品；真空冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司产品；高效液相色谱仪，大连依利特分析仪器有限公司产品；UV-2550型紫外分光光度计，日本岛津公司产品；370DTGS型红外光谱仪，Thermo公司产品；721型可见光分光光度计，上海光谱仪器有限公司产品；HH-4型数显恒温水浴锅，国华电器有限公司产品；MCO-18AIC型CO2培养箱，日本三洋设备有限公司产品；CKX41型倒置显微镜，日本奥林巴斯有限公司产品；Fax2100型酶联免疫检测仪，美国Awareness公司产品；流式细胞仪，Beckman公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 硒化牡蛎多糖的制备

精确量取1.0 g采用Sevage法除蛋白后的牡蛎多糖放入三颈瓶中，加入0.5%硝酸溶液和一定质量的亚硒酸钠并在70℃水浴锅中搅拌反应8 h；待反应后溶液降到室温，调pH值至中性；取4倍体积95%的乙醇进行醇沉，过夜后离心（9 000 r/min，10 min），取沉淀透析3 d；冷冻干燥得硒化牡蛎多糖。

1.3.2 硒化牡蛎多糖的分离纯化

将处理好的DEAE-52装柱，柱床规格为2.5 cm×40 cm。硒多糖上样量为10 mg/mL，流速为3 min 2 mL，采用浓度为0～0.5 mol/L NaCl洗脱。苯酚硫酸法检测多糖含量并收集各主峰，透析3 d，冷冻干燥得纯化的硒化牡蛎多糖。

1.3.3 硒含量测定

参考葛明明等人蒲公英硒化多糖工艺，采用HPLC法，以色谱峰面积为纵坐标Y、硒标准溶液质量浓度为横坐标X，绘制硒溶液的标准曲线并测定硒化牡蛎多糖中的硒含量。

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1.3.4 体外抗氧化活性试验

（1） DPPH·清除能力测定。取2 mL不同质量浓度牡蛎硒多糖溶液与0.1 mmol/L DPPH·溶液2 mL混合，避光30 min，于波长517 nm处测定吸光度，记为A1。以无水乙醇代替DPPH·，记为A0。蒸馏水代替样品记为A2。

（2） ABTS+清除率测定。取 0.4 mL不同浓度牡蛎硒多糖溶液与1.6 mL ABTS+工作液混合，避光静置6 min于波长517 nm处用分光光度计测定样液吸光度，记为A1。PBS（pH值7.4，磷酸缓冲溶液）代替样品，记为A0；PBS代替ABTS+记为A2.

（3）·OH清除率测定。取2 mL不同浓度牡蛎硒多糖溶液与9 mmol/L FeSO4溶液1 mL，9 mmol/L水杨酸-乙醇1 mL，8.8 mmol/L过氧化氢1 mL，于37℃下反应30 min，于波长510 nm处测定吸光度Ax；蒸馏水代替样液吸光度A0；蒸馏水代替过氧化氢记为Ax0。

（4）铁还原能力测定。取1 mL牡蛎硒多糖溶液与0.2 mol/L pH值6.6磷酸盐缓冲液2.5 mL，1%铁氰化钾1 mL，于50℃下反应20 min，加入10%三氯乙酸5 mL静置10 min，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸馏水，0.1%三氯化铁0.5 mL，静置10 min。

于波长700 nm处测定吸光度A1。用去离子水代替0.1%三氯化铁记为A2。

1.3.5 体外肿瘤生长抑制

采用MTT法对HepG2及Hela细胞存活生长率进行测定。取对数期的肿瘤细胞经0.25%胰蛋白酶消化后，用培养液调整细胞浓度至2×104个/mL接种于96孔培养板中，每孔90 μL，培养24 h使细胞贴壁。加入终质量浓度分别为25，50，100，200 μg/mL的硒化牡蛎多糖，每组设4个复孔，另外设阴性对照组和空白对照组，于37℃，5%条件下的CO2培养箱中培养48 h，每孔加入0.5%的MTT溶液10 μL，继续培养4 h。弃去培养液，每孔加入100 μL DMSO（细胞级），振荡10 min，使结晶物充分溶解。用酶联免疫检测仪于波长570 nm处测定各孔的吸光度计算细胞增殖抑制率：

1.3.6 流式细胞术检测肿瘤细胞周期

取对数生长期细胞1×105浓度接种于6孔板，每组设2个复孔，待细胞贴壁，加入终质量浓度为200 μg/mL的硒化牡蛎多糖继续培养48 h。用EP管收集培养液，胰酶消化剩余贴壁细胞，将培养液加入原孔中终止消化以转速1 000 r/min离心5 min收集细胞。用PBS清洗3次，每次清洗后均用离心，弃上清液。将细胞固定于预冷的70%乙醇中过夜。次日离心除去固定剂，PBS清洗2次后，重新将细胞悬于含有PI及无DNA酶污染的RNase的染液中，于37℃，5%条件下CO2的培养箱中避光孵育30 min，用流式细胞仪进行检测。

2 结果与分析

2.1 硒化牡蛎多糖DE-52分离纯化

硒化牡蛎多糖DEAE-52的洗脱曲线见图1。

图1 硒化牡蛎多糖DEAE-52的洗脱曲线

由图1可知，硒化牡蛎多糖经DEAE-52层析分离获得2个组分SeOPS-I和SeOPS-II。

2.2 硒化牡蛎多糖硒含量的测定及红外光谱分析

采用HPLC法测得硒含量为42.36 mg/g，硒化牡蛎多糖平均收率为26.03%。

牡蛎多糖红外光谱见图2，硒化牡蛎多糖红外光谱图见图3。

图2 牡蛎多糖红外光谱

由图2和图3可知，硒化后的牡蛎多糖红外光谱在762 cm-1处和1 030 cm-1处出现峰，在762 cm-1处和1 030 cm-1处附近有亚硒酸酯特征吸收峰，表明硒化牡蛎多糖分子中存在亚硒酸基团，可推断硒化反应后的牡蛎多糖中含有Se=O键，即硒化反应后生成牡蛎硒多糖。

图3 硒化牡蛎多糖红外光谱图

2.3 硒化牡蛎多糖的体外抗氧化活性

硒化牡蛎多糖对DPPH·清除作用见图4，硒化牡蛎多糖对ABTS+清除作用见图5。

图4 硒化牡蛎多糖对DPPH·清除作用

图5 硒化牡蛎多糖对ABTS+清除作用

由图4和图5可知，硒化牡蛎多糖对DPPH·和ABTS+都有很好的清除作用。清除效果与多糖浓度在一定范围内呈正相关。以VC作为参照，硒化牡蛎多糖对DPPH·的清除率IC50值为7.102 mg/mL。当质量浓度为10 mg/mL时清除能力达到70.9%。而对ABTS+的IC50值可达到2.243 mg/mL。当质量浓度为8 mg/mL时，硒化牡蛎多糖清除率为90.4%。这说明硒化后牡蛎多糖对ABTS+有很好的清除作用。

硒化多糖对·OH的清除作用见图6。

图6 硒化多糖对·OH的清除作用

硒化牡蛎多糖对·OH的清除率也随质量浓度的增长呈上升趋势，但当质量浓度增加到20 mg/mL时，其清除率仅为44.9%。参考郝苗等人对硒化枸杞多糖的报道，当质量浓度为2.0 mg/mL时，硒化枸杞多糖对·OH的清除率就达到56.16%。结果对比说明硒化牡蛎多糖对·OH清除效果并不理想。

硒化多糖对铁还原力见图7。

图7 硒化多糖对铁还原力

硒化后的牡蛎多糖具有一定的铁还原力，还原力也是潜在抗氧化的重要表现。根据研究比较质量浓度为2 mg/mL的硒化牡蛎多糖其还原力与牡蛎多糖相近，二者还原力无明显差别。

2.4 硒化牡蛎多糖对肿瘤细胞的生长抑制

牡蛎多糖和硒化牡蛎多糖对Hela生长抑制作用（n=4） 见表 1。

表1 牡蛎多糖和硒化牡蛎多糖对Hela生长抑制作用（n=4）

由表1可知，质量浓度25～200 μg/mL牡蛎多糖（OPS）对宫颈癌细胞并没有抑制作用。而硒化后的牡蛎多糖（SeOPS-II）作用于宫颈癌细胞具有一定的抑制作用，且抑制作用与SeOPS-II质量浓度呈正相关。SeOPS-II质量浓度达到200 μg/mL时，对肝癌细胞抑制率为25.23%，抑制作用显著提高。

牡蛎多糖和硒化牡蛎多糖对HepG2生长抑制作用 （n=4） 见表2。

表2 牡蛎多糖和硒化牡蛎多糖对HepG2生长抑制作用（n=4）

由表2可知，OPS对HepG2细胞增殖具有抑制效果，但效果并不显著。而修饰后的SeOPS-II对HepG2细胞在一定质量浓度范围内生长抑制作用较为显著，并且抑制作用与质量浓度成正比，当质量浓度达到200 μg/mL时，抑制作用可达到22.6%，具有显著差异性p＜0.01。

2.5 流式细胞术检测细胞周期结果

Hela细胞周期分布图见图8，硒多糖作用Hela细胞周期分布图见图9，Hela细胞周期分布见图10。

图8 Hela细胞周期分布图

图9 硒多糖作用Hela细胞周期分布图

通过PI单染色法对Hela细胞加药前后细胞周期进行比较。由图10可知，细胞在G1期、S期和G2/M期均有分布，每个时期的细胞数量分别为67.3%±0.01%，28.88%±0.02%和3.82%±0.01%。

加入硒化牡蛎多糖作用48 h后（见图9），Hela细胞主要集中在G1期。与对照组相比，G1期的细胞数量相对増多，已经达到72.12%±0.01%；S期和G2/M期的细胞分布减少，S期的细胞量减少到25.28%±0.01%，G2/M期的细胞减少到2.59%±0.01%。经比较分析，加入硒多糖后Hela细胞主要停滞在G1期，促使损害后的碱基无法复制，从而使进入S期及G2/M期的细胞数减少，阻碍了细胞周期发展，从而达到抑制细胞增殖的目的。

HepG2细胞周期分布图见图11，硒多糖作用HepG2细胞周期分布图见图12，HepG2细胞周期分布图见图13。

图10 Hela细胞周期分布

图11 HepG2细胞周期分布图

图12 硒多糖作用HepG2细胞周期分布图

图13 HepG2细胞周期分布图

通过PI单染色法对HepG2细胞加药前后细胞周期进行比较。由图13可知，相对于空白组，硒化牡蛎多糖组G0/G1期细胞少量增加，S期细胞由原来32.29%±0.02%增加到35.11%±0.02%，M期细胞由原来的12.87%±0.02%变为9.64%±0.02%，细胞数明显减少。说明硒化牡蛎多糖主要作用于HepG2细胞S期来抑制细胞增殖，同时对G0/G1期也具有一定作用。

3 结论

通过化学方法将有机硒与牡蛎多糖结合，并通过HPLC法及红外对硒含量及硒多糖结构进行分析验证牡蛎多糖硒化。在抗氧化方面，硒化牡蛎多糖对部分指标具有很好的抗氧化活性。经研究表明，部分硒多糖具有强大的抗氧化特性，含硒多糖可考虑作为膳食补充剂中的新型硒源。在抗肿瘤方面，硒化牡蛎多糖在一定范围内对Hela细胞和HepG2细胞增殖具有抑制作用且呈现质量浓度依赖性。细胞周期结果显示硒化牡蛎多糖可通过阻碍细胞G0/G1期及S期的发育从而抑制肿瘤细胞增殖。合理范围内摄入硒多糖可以提高人体免疫力。