基于噬菌体进行细菌检测的研究进展

胡 宇，苟惠天

（1.中农威特生物科技股份有限公司，甘肃 兰州 730046；2.甘肃农业大学 动物医学院，甘肃 兰州 730070）

细菌感染已造成严重的社会经济损失。由细菌引起的人脓毒血症是高收入国家的第十大死因[1]。此外，医院是病原菌发生的自然场所，欧洲每年有410万患者受到与医疗卫生有关的感染。在美国，医院感染每年导致10万人死亡。食品工业也极易受到细菌污染。2015年，180万人死于食用受感染的食物或水。所有这些都需要迅速和可靠地检测和鉴定细菌。传统的检测方法是先分离培养目标菌，然后进行生化鉴定。该方法虽然便宜，但大多需要72 h才能得到检测结果。这在医疗、食品加工等行业由于检测耗时，显示出很大弊端。随即，出现一些新的检测方法，如PCR方法、DNA芯片、酶联免疫吸附试验和质谱分析等[2-4]。但以上方法都需要专业的设备，操作者具有一定的专业技能，而且费用昂贵。另外，核酸为基础的各种分析方法在细菌死亡的情况下容易产生假阳性结果。同时，PCR方法敏感性很高，不同的菌株或突变体可能无法得到正确的鉴定。基于免疫学的各类检测方法，在很大程度上又受到抗体的限制。综上，近年来将生物传感器应用于细菌检测，被认为是一种很有发展前景的方法[5,6]。

噬菌体是特异性感染细菌的一类病毒，它们对宿主细菌的天然亲和力可用于设计高度特异性的工具。由于自然界存在大量形状和性质不同的噬菌体，因此可以设计检测几乎所有细菌菌株的生物传感器。鉴于噬菌体对细菌具有高特异性，因此可以筛选到一些选择性检测目标细菌的噬菌体。另外，与抗体不同，噬菌体的批量生产简单且廉价，通过感染细菌溶液即可获得大量的子代噬菌体。这些优势使噬菌体成为生物传感器和其他分析中进行细菌识别的首选物质[7]。

在细菌检测中，基于噬菌体的生物传感器有几种可能的设计。最直接的是利用野生型噬菌体，因为它们在自然界中无处不在。也可对噬菌体进行基因工程改造，改造修饰后可更好地应用在一些特殊的细菌检测中[8]。最初，利用噬菌体分型方法可对细菌种类进行鉴定。该方法主要通过观察是否形成特性噬菌斑来判定。随后，噬菌体还用于细菌的检测。例如，噬菌体可以作为简单的识别元件，将靶细菌和检测中的其他化合物（标记物等）进行连接。噬菌体沉积在固体基质上形成传感层，结合适当的传感器后，便成为传统意义上的生物传感器。另外，细菌检测中还可通过判定噬菌体的扩增和细菌裂解物的释放来实施。针对细菌检测中的噬菌体不同研究，综述如下。

1 噬菌体作为检测信号

噬菌体感染过程导致细菌内噬菌体扩增，并在细菌裂解后释放噬菌体。在此过程中释放的细胞内物质含有多种化合物，对它们的选择性检测可作为细菌存在的标志。例如，Chen等在T7噬菌体介导的靶细菌裂解后检测到β-半乳糖苷酶的释放[9]。β-半乳糖苷酶能使氯酚红β-d-半乳糖苷由黄色变为红色，从而使比色分析成为可能。利用该方法可检测到浓度为104CFU/ml 的大肠杆菌。随后，Chen等利用释放的β-半乳糖苷酶催化生成对氨基酚(PAP)，PAP还原离子银，在金纳米颗粒上形成银层，导致表面等离子体共振峰的蓝移，但该方法并没有提高检测限。另一种方法，是将检测β-半乳糖苷酶，基因修饰噬菌体以及电化学三者结合起来[10]。基因修饰后的T7噬菌体在大肠杆菌内引起β-半乳糖苷酶的过量表达，催化PAP生成，然后用伏安法检测PAP。除了β-半乳糖苷酶，荧光素酶，蛋白酶或碱性磷酸酶也被证明可用于这种检测。这些方法的操作原理基本相同，都是基于酶催化与发光产物的反应。

噬菌体感染细菌的内在作用是将许多子代噬菌体释放到环境中。在细菌感染的溶液中加入少量特异噬菌体，会导致样品中噬菌体浓度迅速增加。噬菌体数量的增加被证明是细菌检测的另一个理想信号。Anany等研究表明，大肠杆菌感染中产生的子代噬菌体可以用实时定量PCR来检测[11]。该方法对布鲁氏杆菌的检测也有一定的参考价值[12]。Rees等展示了一种基于串联质谱（LC-MS/MS）的技术，用于检测胰蛋白酶消化K噬菌体后，形成的蛋白质和多肽。该方法也适用于金黄色葡萄球菌对抗生素敏感性的测定。如果在含有抗生素的样本中检测到噬菌体扩增，则认为该样本对这些抗生素具有耐药性[13]。另外，通过横向免疫层析（LFI）也可检测噬菌体。Cox等报道，横向流动导致染色的纳米粒子与从炭疽芽孢杆菌中释放的子代噬菌体结合，然后，将这种标记的噬菌体浓缩在膜上，即形成可肉眼观察的有色线[14]。

利用噬菌体在不裂解宿主细菌的情况下，也可以检测细菌。其原理是利用基因工程方法制备报告噬菌体，感染细菌，进入溶原循环后在完整细菌内产生检测信号。Vinay等使用具有编码绿色荧光蛋白（GFP）的温和噬菌体HK620和P22分别感染大肠杆菌和沙门氏菌。GFP在感染的细菌内表达并被检测[15]。此外，编码荧光素酶的噬菌体也可用于细菌检测。Sharp等用编码荧光素酶的温和噬菌体φV10感染大肠杆菌，在加入荧光素后产生强烈的发光信号，此方法能够在2 h内检测到105CFU/ml的大肠杆菌。Wu等改造PP01噬菌体，使其携带与外壳蛋白融合的四半胱氨酸标签。该噬菌体感染大肠杆菌产生子代噬菌体后，用膜渗透染料标记四半胱氨酸标签来染色细菌，通过流式细胞术或荧光显微镜即可检测单个细菌[16]。

2 利用噬菌体形成传感层

使用噬菌体检测细菌的方法，是将噬菌体颗粒固定在固体基质上作为特异性生物受体。Bennett等1997年首次报道了通过固定的噬菌体捕获宿主细菌进行特异性检测的技术。对于噬菌体传感层，选择适当的传感器以实现信号读出，显得尤为重要[17]。Srivastava等在纳米硅平台上用4-氨基苯硫酚和戊二醛修饰银薄膜，然后在其表面固定T4噬菌体，利用表面等离子体共振技术（SERS）提高细菌检测的敏感性，检测限为102CFU /ml[18]。Horikawa等利用包被噬菌体的磁弹性生物传感器来检测鼠伤寒沙门氏菌，通过共振频率的实时变化，能够精确测量超低浓度的细菌[19]。

近年来，利用电化学阻抗谱（EIS）进行细菌检测的报道越来越多。Bhardwaj等利用固定的噬菌体对石墨烯电极上的金黄色葡萄球菌进行选择性检测[20]。另外，利用EIS获得的生物传感器性能稳定，检测范围广，灵敏度高。该技术还可用于分析原始样品（屠宰污水，血液等）。Moghtader等将碳电极和EIS技术结合，用金纳米颗粒包被石墨电极，随后再用T4噬菌体包被，这样不仅增加金纳米颗粒的表面电导率，而且还能有效固定噬菌体[21]。除了电化学阻抗谱，也有学者提出了其他电化学方法。在检测细菌铜绿假单胞菌时，电化学发光被用于检测与PaP1噬菌体缀合的羧基石墨烯层的信号[22]。

随后，大量研究都集中在改进噬菌体传感层的性能。最直接的方法是通过增加定向噬菌体的数量来增强信号。Wang等提出一种噬菌体在聚羟基链烷酸酯表面沉积的新方法，同时提出该表面的噬菌体数量不应超过一定限度，覆盖率过高会导致噬菌体间的空间位阻[23]。Olsson等人对最佳噬菌体覆盖率进行了分析，提出超过95%的噬菌体在传感层中具有共同的定向结构，包括头部和具有纤维组织的尾部。受体结合蛋白就位于纤维末端和尾部，噬菌体只能用一端检测并结合细菌。因此，噬菌体定位对于有效检测细菌至关重要。有研究报道，将噬菌体的头部进行重组修饰，使其能与传感器表面上抗生物素蛋白相结合。也有利用非基因工程方法，进行噬菌体定向的报道。噬菌体具有带负电的头部和带正电的纤维尾部，因此可以通过静电作用或在电场中进行定向。与物理吸附的噬菌体相比，表面化学修饰与交替电场相结合的方法，导致传感层的灵敏度增加60倍，检出限提高到100 CFU/ml[24]。

3 利用噬菌体捕获靶细菌

噬菌体在细菌检测中可作为生物复合物的一部分。通常，噬菌体与特定的纳米颗粒结合，用于制备靶向细菌的生物复合物，即可从复杂样品中分离或检测细菌。磁分离技术不需要额外的离心或过滤。此外，还能够将目标细菌与复杂样本中的其他成分有效分离，从而最大限度地减少信号收集过程中的基质干扰。Liebana等首次提出，P22噬菌体固定在甲苯磺酰化的磁性颗粒上，可以特异性捕获和预浓缩沙门氏菌，之后再通过电化学磁传感器检测细菌，可使检出限降至3 CFU/ml[25]。但检测程序复杂，设备试剂昂贵等缺点在很大程度上限制了该方法的广泛应用。因此，有学者提出将噬菌体分离与RT-PCR结合。利用磁分离技术，从样品中分离大肠杆菌O157: H7后，噬菌体感染导致大肠杆菌裂解并释放内容物，通过RT-PCR定量检测释放的DNA，所有测定在2 h内完成，LOD为102CFU/mL[26]。

也有研究将磁分离与酶比色检测相结合。Laube等将该方法用于沙门氏菌的快速检测。首先，沙门氏菌被经过修饰的噬菌体-磁性纳米颗粒复合物捕获，依次加入与辣根过氧化物酶(HRP)结合的特异性抗沙门氏菌抗体及底物(四甲基联苯胺，TMB)后，在450 nm处测定吸光度。该方法在2.5 h内便获得了牛奶样品中19 CFU/ml的检测限[27]。更有研究，将大肠杆菌的T4噬菌体与双功能磁荧光微粒子共价结合。磁性促进捕获细菌的分离，荧光使细菌-生物结合物的简单分析成为可能，利用流式细胞术使整套细菌检测在15 min内即可完成。由于检出限较低，该方法适用于快速、特异的筛选试验[28]。细菌磁性分离技术能够将目标细菌与样品的其他组分离，无需任何预富集。因此，可以大大缩短整个细菌检测分析的时间。

4 结语

利用噬菌体检测细菌的相关研究已有诸多报道。但由于种种原因，基于噬菌体的诊断方法仍然只有少数被商业化应用。近年来，生物传感器、纳米技术等新型技术的介入，有效提高了检测方法的灵敏度、稳定性和重复性。但进一步的发展仍需要生物学、化学、物理学等多学科密切合作，才能提出快速、敏感、低廉的检测方法。