循环肿瘤DNA在结直肠癌中的临床应用及研究进展

余柳莹 鲍轶

[摘要] 作为液体活检的一部分，ctDNA检测因其实时动态、无创、可重复性等优势，已经被广泛研究。随着生活方式的改变，结直肠癌越来越高发，而ctDNA在协助结直肠癌早期诊断，疗效监测，复发预防等方面发挥重要作用，这在实现结直肠癌的精准化治疗方面有巨大发展潜力。

[关键词] 液体活检;循环肿瘤DNA;结直肠癌;诊断

[中图分类号] R735.34          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2019）01-0161-04

Clinical application and research progress of circulating tumor DNA in colorectal cancer

YU Liuying1， 2   BAO Yi1， 2

1.Graduate School of Bengbu Medical College， Bengbu   233000， China; 2.Department of Central Laboratory， Jiaxing Second Hospital， Jiaxing   314000， China

[Abstract] As part of liquid biopsy， ctDNA detection has been widely studied due to its real-time dynamic， non-invasive and reproducible advantages. With the change of lifestyle， colorectal cancer is getting increasing incidence. While ctDNA plays an important role in assisting early diagnosis of colorectal cancer， monitoring of curative effect， prevention of recurrence， etc.， which has great potential development in achieving accurate treatment of colorectal cancer.

[Key words] Liquid biopsy; Circulating tumor DNA; Colorectal cancer; Diagnosis

近年来，随着生活环境和方式的改变，我国结直肠癌的发病率越来越高，年轻化趋势也越来越明显。据数据统计[1]，2015年我国结直肠癌新发病例376 300人，死亡人数19 100人。如果能早期确诊，检测基因突变，指导用药，动态实时监测肿瘤复发和转移，这对于提高患者生存率、改善预后有非常大的价值。

组织病理活检是确诊肿瘤的金标准，但其反映的是肿瘤在某一时间点的状态，不能动态监测肿瘤的改变，且组织活检是一种有创手段，可能会使患者出现相应的并发症。因此，无创且能实时监测肿瘤进展的“液体活检”技术应运而生，循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）检测即其中的一种。循环肿瘤DNA不仅可作为结直肠癌的一种生物学标志物，还能监测出基因突变情况，预测结直肠癌的复发与转移，进行疗效和预后评估，对早期诊断、改善患者预后有重要价值。本文就ctDNA在结直肠癌中的临床应用及研究进展作一综述。

1 ctDNA的来源与特性

1948年，Mandel和Métais在外周血中发现存在大量的降解的DNA片段，称为循环游离DNA（circulating free DNA，cfDNA）[2]，主要来自于坏死或凋亡的细胞，片段长度集中在180～200 bp，可在血液、尿液、痰液、脑脊液、滑膜液、粪便中被检测到。数十年后，人们发现了循环肿瘤细胞DNA（ctDNA），是指由肿瘤细胞脱落或者凋亡后释放到血液循环系统中的双链DNA片段。ctDNA为cfDNA的一部分，ctDNA只来源于肿瘤细胞，而cfDNA既可来源于肿瘤细胞也可来源于正常细胞。虽然ctDNA由肿瘤细胞凋亡后释放，但其在肿瘤患者体内的含量很低，约占整个cfDNA的1%，甚至只有0.01%[3]。同时，其半衰期也很短，只有大约2 h。相关研究表明[4]，ctDNA的遗传突变信息来自于肿瘤细胞的体细胞突变，故ctDNA所携带的肿瘤相关信息与肿瘤组织具有一致的生物学特性。肿瘤的类型、部位、负荷、分期、转移灶、血管浸润等因素均会影响ctDNA的量，因而，测量差异较大。ctDNA攜带患者一定的肿瘤基因信息（包括突变、重排、缺失、插入、基因拷贝数变异、微卫星改变、甲基化等），因此，对其进行相关的分析可为肿瘤的诊治提供重要线索。

2 ctDNA的检测方法

2.1 ctDNA的提取

血浆中ctDNA的提取目前有以下几种方法：盐析法、酚-氯仿-异戊醇法、微柱吸附法、磁珠吸附法、Qiagen blood Kit法等。提取方法不同，所得到的DNA效率也不同。其中，硅胶膜吸附柱法最为常用[5]，磁珠法假阳性率高于微柱吸附法，而Qiagen blood Kit法相比其他方法对小片段DNA提取效率最高，稳定性也较好[6]。

2.2 ctDNA的检测

ctDNA的检测包括定量和定性检测。定量检测主要是指对其总量进行检测，而定性则包括检测肿瘤相关基因突变、微卫星不稳定性和杂合性缺失、基因过表达、甲基化、基因组不稳定性、完整性评估、拷贝数变化分析、染色体重排分析等不同方面。因ctDNA占cfDNA的含量较少，故定量检测时常建立在PCR 技术基础上，如实时荧光定量PCR、甲基化特异性PCR、数字PCR等。近几年来，数字PCR一流式技术BEAMing（beads emulsion amplification magnetic）、PAP法，微滴式数字PCR（ddPCR）、全基因组测序、全外显子测序、深度测序、肿瘤个体化深度测序分析（cancer personalized profiling by deep sequencing，CAPP-Seq）、液相色谱法、突变扩增阻滞系统（amplification refractory mutation system， ARMS）法、NGS高通量检测技术等广泛被用于ctDNA的定性分析检测。其中，BEAMing法敏感性较高，能检测出比例在1：10000以下的基因突变，该法已用于临床试验[7]。CAPP-Seq法采用二代测序平台检测基因组变异并结合RNA探针捕获技术，大大提高了测序深度，可有效检测出ALK与ROS1融合在内的各种基因突变[8]。

3 ctDNA在结直肠癌中的应用

3.1 早期筛查和诊断

虽然癌胚抗原（CEA）等指标常作为筛查结直肠肿瘤的一种标记物，但其特异性、敏感性均不是很高，而ctDNA一般存在于肿瘤细胞中，在正常细胞中检测不出。有研究结果得出[9]，结直肠癌患者血浆ctDNA水平较健康人明顯升高，认为将ctDNA与CEA进行联合检测，可作为结直肠癌早期筛查的指标。

3.2 基因突变检测

在结直肠癌发生发展过程中，包括在腺瘤阶段，原癌基因KRAS突变是最早的遗传改变[10]。在结直肠癌患者的血浆ctDNA也常可检测到KRAS突变，且ctDNA中KRAS突变状态与肿瘤组织存在较高的一致性[11]，这对于后期指导患者用药，个体化治疗非常有帮助。有研究分析了206 例转移性结直肠癌患者ctDNA中KRAS突变情况，结果显示其敏感性为87.2%，特异性为97.2%[12]。此外，Kidess E等[13]还发现血浆ctDNA可检测出组织未检测出的突变位点，同时在预测结直肠癌肝转移时血浆ctDNA比CEA和影像学检查更及时，这对于结直肠癌患者来说又是一大福音。

3.3 完整性评估

DNA中的短分散重复序列ALU序列以及cfDNA完整性指数CFDI（即ALU长、短片段含量的比值）可间接反映ctDNA含量，这在结直肠癌诊断中得到广泛研究。2013年，Da等[14]学者对60例CRC患者及33例健康者进行对照研究，结果显示，手术组（33例）患者血浆CFDI均值（0.08）显著大于健康对照组（P<0.01）、非手术组（27例）患者与健康对照组（P=0.019）、手术组与非手术组（P=0.005）以及手术组与健康对照组（P=0.043）。以上几组血浆CFDI差异均有统计学意义。Hao TB等[15]对结直肠癌患者血浆ctDNA中ALU重复序列进行检测，发现其ALU247/115明显高于结肠息肉患者及健康对照者，且术后其含量明显降低，表明ctDNA的完整性在CRC的诊断中也有一定价值，可用于临床诊断及疗效评估。

3.4 ctDNA甲基化

DNA甲基化是指DNA在甲基转移酶（DNA methyl transferase，DNMT）的作用下，利用S-腺苷甲硫氨酸的甲基，将甲基基团合成到胞嘧啶的5位碳原子上，从而形成5-甲基胞嘧啶。Grützmann R等[16]与Warren JD等[17]学者开展的早期结直肠癌的回顾性研究中，对比不同分期CRC患病人群的血浆ctDNA中SEPT9启动子甲基化水平，结果显示，ctDNA甲基化对CRC诊断的敏感度为72%～90%，特异度为88%～90%。同样，Danese E等[5]也发现在早期结直肠癌患者中SEPT9启动子甲基化比率明显高于KRAS突变的比率，这可能与抑癌基因甲基化比癌基因突变更稳定相关，也可能与肿瘤负荷有关，因此，ctDNA异常甲基化检测在结直肠癌早期筛查或诊断中的应用已更快的从基础研究走向临床。

3.5药物筛选

有研究报道，ctDNA的浓度与肿瘤负荷呈正相关，与有效药物治疗或手术治疗呈负相关。通过ctDNA的基因分析来寻找结直肠癌患者的药物敏感的突变位点，这对于临床用药具有很好的指导意义，如西妥昔单抗对KRAS突变的结肠癌有很好疗效[18]。但结直肠癌患者在临床治疗过程中往往会出现耐药或对药物抵抗情况，动态监测临床用药进展，及时调整药物治疗，能使患者临床获益更大。Spindler KL等[19]在检测结直肠癌患者ctDNA中的KRAS突变情况过程中，发现血浆KRAS的突变状态或突变量与耐药相关。另一类似研究发现[12]，原发性结直肠癌患者血浆中的KRAS DNA片段原未检测出16号密码子突变，但使用EGFR阻滞剂治疗后，患者血浆ctDNA中KRAS的突变频率显著升高，检出率约为46%。Diaz LA等[20]研究中选取KRAS野生型的转移性CRC患者，经靶向治疗后仍有部分患者发生耐药，发现在治疗前检测患者血浆ctDNA中KRAS基因突变情况，已有低频亚克隆的突变存在，只是当时受限于某些条件未被检测出。另外，还可通过定量检测基因拷贝数的增加来预测疗效，例如使用定量PCR检测转移性结直肠癌患者血浆ctDNA中KRAS突变水平，低水平的KRAS突变说明使用第三代西妥昔单抗和伊立替康治疗后疗效尚可，而高水平血浆KRAS突变则提示靶向治疗后预后不良或出现耐药[12]。吴疑等[21]研究发现，转移性结直肠癌患者使用EGFR单克隆抗体治疗后，通过监测ctDNA，可发现其存在RAS/RAF基因变异，说明患者对上诉药物发生耐药现象。通过监测结直肠癌患者血浆ctDNA中靶向治疗相关基因谱的变化，有望以此来指导临床治疗，调整靶向药物，实现个体化治疗和精准治疗。

3.6疗效与预后评估

邢宝才等[22]发现，血浆ctDNA能更早且及时的进行疗效评估，术前化疗的结直肠癌肝转移患者，血浆ctDNA在化疗2周期后即可检测出显著下降，而CT评价只能在化疗开始后的8～10周后才能进行。有研究[12]检测了108例行西妥昔单抗和伊立替康联合化疗的转移性CRC患者治疗前血浆ctDNA中KRAS和BRAF基因突变定量基线水平，统计后发现，KRAS突变水平高于75%的患者，相比低突变水平的患者疾病控制率差（P<0.048）。Lecomte T等[23]对37例CRC患者进行生存分析的研究中发现，患者发生KRAS基因突变2年整体生存率仅48%（95%CI为26%～66%），而未发生基因突变者2年整体生存率可达100%。以上两项研究的COX回归分析均证实，结直肠癌患者血浆ctDNA中KRAS基因突变是预后的独立因素，KRAS基因突变水平越高，CRC患者的预后越差，这对有效评估CRC患者预后具有重要价值。

3.7复发监测

ctDNA被认为是结直肠癌切除术后监测复发和残留病灶的潜在标志物。有研究监测了结直肠癌患者术后2～5年ctDNA的情况，结果显示术后ctDNA阳性患者肿瘤复发或转移，而未检测到ctDNA的患者没有复发[3]。有研究也得出了类似结论，且认为检测ctDNA时间应在手术后（一般为手术后6～8周）、辅助治疗之前。在对18例結直肠癌患者进行的一项研究中发现，第一次局部切除肿瘤时，患者血浆ctDNA含量没有降低，第二次完全切除肿瘤时，患者血浆ctDNA含量明显降低[3]。因此，ctDNA有望成为监测结直肠癌复发和转移的指标。

4 ctDNA存在的缺点

血浆ctDNA检测虽然在结直肠癌的早期诊断，基因突变检测，疗效评价，预后评估等方面有较大的价值。但ctDNA检测本身仍存在一些不足：（1）临床上暂时没有统一的标准表明哪一种方法提取和纯化ctDNA是最佳的，因此检测方式不同会导致结果差异较大。（2）ctDNA在血浆中的含量较少，检测较为困难，需寻找能提高血浆ctDNA富集量的方法。（3）ctDNA尚无准确的阈值来判断阳性指标，如转移或者复发等。（4）若ctDNA与影像学检查、CEA等传统诊断方法的不一致时，判断较为困难。而在检测技术方面也存在一些缺点：（1）检测技术花费较大，有些患者较难接受。（2）检测方法较多，医生和患者较难选择。（3）检测技术的许多机制尚未阐明，可靠性有待检验。

5 展望

“液体活检”作为一项新起的前沿技术，在肿瘤的诊断、评估、监测中有巨大潜力[24]。血浆ctDNA检测作为液体活检技术的一部分，在结直肠癌的早期筛查、诊断、基因突变检测、病情及疗效评估、监测复发等方面都存在较大的价值。但目前国内外较多的研究还只是停留在小范围的临床样本上，缺乏大数据的统计分析，未能真正的广泛应用于临床。故我们需要更多大样本、前瞻性的研究来证明ctDNA的价值，同时解决ctDNA一些可攻克的困难，从而在临床上真正实现结直肠癌患者的个体化和精准治疗。目前，结直肠癌的患者越来越多，ctDNA也许能成为结直肠癌诊断、治疗、动态监测上的一个新的突破点，给广大患者带去福音。

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