Notch1/Hes1信号调控C/EBPα表达对AECII细胞增殖与分化的影响*

万峰云，卢红艳，万雪晴，朱 玥，郝晓波

(江苏大学附属医院儿科， 江苏 镇江 212001)

肺泡II型上皮细胞(type Ⅱ alveolar epithelial cell，AECII)是肺内主要干细胞，能合成和分泌肺泡表面活性物质，并增殖及分化为肺泡I型上皮细胞(type I alveolar epithelial cell，AECI)，在肺发育及肺损伤中发挥重要作用[1-3]。 CCAAT/增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer-binding protein α，C/EBPα)是亮氨酸拉链转录因子家族成员之一，在细胞增殖、分化、信号传导、肿瘤发生、机体免疫及应激反应等方面发挥重要作用[4-5]。在肺脏中C/EBPα主要在呼吸道上皮细胞及AECⅡ中表达[6]。De Obaldia等[7]发现，C/EBPα启动子上游有Hes1结合位点，即N-box位点。Hes1是Notch信号中非常重要的靶基因，属于碱性螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix，bHLH)转录因子。有研究表明,Notch信号可能通过介导bHLH转录因子表达，调控肺泡上皮和血管内皮细胞增殖、分化及迁移等生物学活动[8]。Notch1/Hes1信号是否调控C/EBPα表达从而影响AECII的增殖与分化，目前尚不清楚。本研究通过对Notch1/Hes1信号双向调控，探讨Notch1/Hes1信号是否调控C/EBPα表达从而影响AECII增殖及分化功能，为进一步深入研究其与急、慢性肺损伤和修复的关系奠定基础。

材 料 和 方 法

1 材料

人AECII购自赛百慷公司，细胞来源于人正常肺组织，采用AECII特异性表面活性蛋白C进行免疫荧光染色鉴定，纯度高于90%。胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自维森特生物技术有限公司；RPMI-1640培养基购自HyClone；TRIzol购自Invitrogen；PCR试剂盒购自TaKaRa；抗Hes1抗体购自Immunoway；抗Notch1及β-actin抗体购自Cell Signaling Technology；抗C/EBPα及水通道蛋白5(aquaporin 5，AQP5)抗体购自Santa Cruz；羊抗兔或抗鼠IgG和兔抗羊IgG购自南京福麦斯公司；PE标记的羊抗鼠Ig G购自上海翊圣生物公司；CCK-8 细胞活力检测试剂盒购自Biosharp；细胞周期检测试剂盒购自BD Biosciences；Notch通路激活剂重组人Jagged1购自R&D Systems；Notch通路抑制剂DAPT购自Target Mol。

2 方法

2.1AECII培养及分组 用含10% FBS的RPMI-1640培养基将AECII置于 37 ℃、5% CO2培养箱内培养，1 d换液1次，3 d传代1次。将细胞随机分为对照(control)组、激活剂(Jagged1)组(加入Notch通路激活剂Jagged1蛋白500 μg/L)和抑制剂(DAPT)组(加入Notch通路抑制剂DAPT 10 μmol/L)，分别于干预后24 h收获各组细胞。

2.2RT-qPCR法检测Notch1、Hes1和C/EBPα的mRNA表达水平 用TRIzol 法提取各组AECII总mRNA，纯度及浓度使用微量分光光度计检测。cDNA 按试剂盒说明书合成。PCR体系：12.5 μL SYBR Premix Ex TaqTM；PCR 上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL；0.5 μL ROX Reference Dye Ⅱ(×50)；2.0 μL DNA模板；9.0 μL ddH2O；合计25 μL。PCR 条件：95 ℃ 30 s; 95 ℃ 5 s， 60 ℃ 30 s，40 个循环。 PCR相关引物序列如下：Notch1的上游引物序列为5′-TAGATCCAACCCTTGTGTC-3′，下游引物序列为5′-GACGCACACTCGTTGATGTT-3′；Hes1的上游引物序列为5′-GAGTGCATGAACGAGGTGAC-3′，下游引物序列为5′-GGTCATGGCATTGATCTGG-3′；C/EBPα的上游引物序列为5′-GGTGGACAAGAACAGCAACG-3′，下游引物序列为5′-GGTCAGCTCCAGCACCTTCT-3′；β-actin的上游引物序列为5′-GCAGAAGGAGATTACTGCCCT-3′，下游引物序列为5′-GCTGATCCACATCTGCTGGAA-3′。以β-actin作为内参照，用2-ΔΔCt相对定量法分析。

2.3Western blot 法检测Notch1、Hes1和C/EBPα 的蛋白表达水平 细胞根据分组给予相应处理后，提取蛋白，BCA法测定蛋白含量。等量蛋白经SDS-PAGE分离后，湿转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入稀释的I抗(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，加入稀释的II抗(1∶5 000)，室温下孵育1 h。化学发光显色，用凝胶分析成像系统扫描并分析，测定蛋白质条带吸光度(A)，以A目的蛋白/Aβ-actin比值表示目的蛋白相对表达水平。

2.4CCK-8 法检测AECII的细胞活力 常规消化对数生长期的AECII，配成 5×107/L 细胞悬液，接种于96孔板内，按照实验分组予以细胞不同处理后，分别加入CCK-8 试剂每孔10 μL，在细胞培养箱内孵育2 h，酶标仪于450 nm 波长测定各孔A值。

2.5活细胞计数法检测细胞增殖能力 将细胞接种于6孔板中，根据分组给予相应处理24 h后，用胰酶消化离心重悬，将0.4%台盼蓝染液按1∶1比例加入细胞悬液中，用细胞计数板在显微镜下计数，并算出活细胞数目。实验重复3次。

2.6流式细胞术检测细胞周期 各组细胞给予相应处理后，用不含EDTA的胰酶消化并收集细胞，PBS洗涤细胞3次后，加入预冷70%乙醇，于4 ℃固定过夜，固定结束后离心去除乙醇，用500 μL碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色液(50 mg/L PI+50 mg/L RNase)重悬细胞，37 ℃避光孵育30分钟，用FACS CantoTMII流式细胞仪(BD)检测细胞周期。

2.7流式细胞标记法检测细胞分化 AECII可分化为AECI，AQP5是AECI特异性表面标志蛋白，其表达强弱直接反映AECI数量和(或)功能[9]。流式细胞术标记法检测AQP5，以标记AQP5的阳性细胞代表AECI。收集各组细胞，离心洗涤后，调整细胞浓度为1×108/L。加入鼠抗人AQP5多克隆抗体(1∶100)，混匀，37 ℃孵育30 min，洗涤后，加入PE-抗鼠IgG(1∶100)，避光孵育15 min，上机检测。利用FlowJo软件作图，将细胞分为2个亚群：AQP5+和AQP5-，结果以阳性细胞百分率表示。

3 统计学处理

运用SPSS 19.0进行统计学分析。实验结果以均数±标准差(mean±SD)表示。多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两均数比较采用SNK-q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 AECII中Notch1、Hes1及C/EBPα的mRNA表达

RT-qPCR结果显示，与对照组比，激活剂组Notch1、Hes1及C/EBPα的mRNA表达明显升高(P<0.05)；抑制剂组Notch1、Hes1及C/EBPα的mRNA表达明显降低(P<0.05)，见图1。

Figure 1.The mRNA expression of Notch1, Hes1 and C/EBPα in AECⅡ. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group．

图1AECⅡ中Notch1、Hes1及C/EBPα的mRNA表达

2 AECII中Notch1、Hes1及C/EBPα的蛋白表达

Western blot结果显示，激活剂组Notch1、Hes1及C/EBPα 的蛋白表达水平较对照组明显增高(P<0.05)；抑制剂组Notch1、Hes1及C/EBPα 的蛋白表达水平较对照组明显降低(P<0.05)，见图2。

Figure 2.The protein expression of Notch1, Hes1 and C/EBPα in AECⅡ. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

图2AECⅡ中Notch1、Hes1及C/EBPα的蛋白表达

3 AECII的活力和增殖情况

CCK-8检测结果显示，激活剂组AECII的A450值较对照组明显增加(P<0.05)；抑制剂组AECII值较对照组明显降低(P<0.05)，见图3。活细胞计数结果显示，与对照组比，激活剂组活细胞数明显增加而抑制剂组明显减少(P<0.05)，见图4。

Figure 3.The absorbance (A) value of AECII. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

图3AECII吸光度值

4 AECII周期变化情况

流式细胞检测细胞周期结果示，激活剂组G0/G1期细胞比例较对照组低，而抑制剂组G0/G1期细胞比例明显高于对照组(P<0.05)；激活剂组及抑制剂组S期细胞比例均较对照组低(P<0.05)；激活剂组G2/M期细胞比例高于对照组(P<0.05)，而抑制剂组与对照组无明显差异，见图5。

Figure 4.The relative numbers of AECII. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

图4AECII活细胞计数

5 AECII分化情况

流式细胞术检测AQP5，以标记AQP5的阳性细胞代表AECI。结果显示激活剂组的AQP5阳性细胞百分比较对照组明显降低(P<0.05)；抑制剂组的AQP5阳性细胞百分比较对照组明显增高(P<0.05)，见图6。

讨 论

Notch信号在多种组织和器官早期发育、细胞增殖、分化及凋亡过程中发挥重要调控作用，Hes1是Notch信号中非常重要的靶基因[10]。Jagged1蛋白增加了Notch1信号通路中主要配体数量，直接激活Notch1通路；DAPT(γ-分泌酶抑制剂)能够抑制通路关键酶γ-分泌酶的产生，进而抑制整个Notch1信号系统活性[11]，故目前很多研究采用Jagged1和DAPT分别作为Notch信号通路的激活剂及抑制剂。本研究表明，激活Notch1/Hes1信号可有效上调Notch1与Hes1 mRNA及蛋白水平，而抑制Notch1/Hes1信号可有效下调Notch1与Hes1 mRNA及蛋白水平，可见利用特异性激活剂和抑制剂对Notch1/Hes1信号双向调控成功。AECII是肺内主要干细胞，可增殖分化为AECI。C/EBPα作为调节细胞增殖与分化的关键转录因子，在妊娠后期呼吸道上皮细胞增殖与分化过程中发挥至关重要作用[12]。C/EBPα缺失胎鼠在出生后存在肺结构分化及成熟障碍，极易出现呼吸衰竭而死亡[13]。研究发现[7]，在T细胞发育过程中，C/EBPα转录受Notch信号靶基因Hes1调控，这对于T细胞分化非常重要。在AECII中，C/EBPα转录是否也受Notch1/Hes1信号通路调控，目前尚不明确。本研究发现，激活Notch1/Hes1信号可使C/EBPα mRNA及蛋白水平增加，而抑制Notch1/Hes1信号可使C/EBPα mRNA及蛋白水平降低，表明Notch1/Hes1信号通路可调控AECⅡ表达C/EBPα。

Figure 5.The changes of cell cycle distribution. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group.

图5AECII细胞周期的变化

Figure 6.AQP5 positive cell proportion. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group．

图6AQP5阳性细胞比

Cook等[14]发现，Notch信号活性增强可引起C/EBPα水平增加，骨髓祖细胞数量增加，而抑制Notch信号后C/EBPα表达水平和骨髓祖细胞数量恢复到对照水平，说明Notch信号可调控C/EBPα表达，从而影响骨髓祖细胞增殖。在脂肪组织中，激活Notch信号通路后，C/EBPα表达上调，从而调节前脂肪细胞分化[15]。本研究通过CCK-8法、流式细胞检测细胞周期、活细胞计数及流式细胞标记AQP5了解AECⅡ增殖及分化情况，进一步明确Notch1/Hes1信号通路调控C/EBPα表达是否影响AECⅡ增殖及分化功能。结果显示，与对照组比，激活Notch1/Hes1信号通路，CCK-8吸光度值增加，促进AECII细胞从S期进入G2/M期，活细胞数增加，标记AQP5阳性细胞比减少，说明激活Notch1/Hes1信号通路可促进AECⅡ细胞周期进程且增殖增强而分化减弱；而抑制Notch1/Hes1信号通路，CCK-8吸光度值较对照组减少，G0/G1期细胞比例明显增加，S期细胞比例明显降低，活细胞数减少，标记AQP5阳性细胞比增加，说明AECII阻滞于G0/G1期从而增殖受抑，而AECII向AECI分化增强，提示Notch1/Hes1信号可调控C/EBPα表达从而影响AECII增殖及分化功能。

经过电离辐射的多能造血干细胞造血功能低下，激活Notch信号通路后，C/EBPα表达恢复正常，多能造血祖细胞恢复自我更新[16]。前期研究发现[17-18]，高氧损伤的AECII中Notch1表达降低，Notch信号通路转导受抑，AECII转分化异常，而C/EBPα表达也降低，AECII增殖能力受抑。激活Notch信号通路后能否恢复C/EBPα表达，从而恢复AECII增殖与分化功能，有待进一步研究。