胃萎缩性炎症恶变过程中基因表达谱的变化

丁西平，毛玉娣，汪朝靓，周 欢，程 前

胃癌是我国常见的恶性肿瘤，具有较高的发病率和死亡率[1]。早期胃癌无明显的症状和体征，极大限制了早期的诊断率，并且错过了治疗的最佳时期，因此，目前胃癌的5年生存率仍然不令人满意[2]。胃癌在病理特征上常继发于慢性萎缩性胃炎和异型增生，其中包含众多遗传与表观遗传的改变，基因表达调控网络复杂多元。例如，以往的研究[3]证明多种促炎基因之间相互作用参与胃癌的发生发展。为了提高胃癌早期诊断率，寻找新的临床标志物和治疗靶点，该文应用高通量基因芯片技术，研究胃萎缩性炎恶变过程基因表达谱的变化，并且通过生物信息学分析基因间的相互作用及所涉及的生物过程和信号通路。

1 材料与方法

1.1病例资料临床标本的收集由中国科学技术大学附属第一医院(安徽省立医院)伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。所有标本均来自中国科学技术大学附属第一医院(安徽省立医院)内镜中心，包括5例慢性萎缩性胃炎伴肠上皮化生组织和5例进展期胃癌组织，并符合病理学诊断标准。两组临床标本均来自于男性患者，年龄分别为42～64(55±10.03)岁和45～65(57±9.14)岁(P=0.77)。所有胃癌患者均未接受任何治疗包括手术、化疗、放疗以及生物治疗等。内镜下夹取的标本立即放入RNA later(美国Thermo Fisher公司)溶液中稳定RNA，防止降解，然后储存于-80 ℃冰箱中。

1.2RNA提取与定量TRIzol试剂(美国Invitrogen公司)用来提取各临床标本中总RNA，并进一步采用 NucleoSpin® RNA clean-up试剂盒(740.948.250)对总RNA进行过柱纯化。使用分光光度法(Nanodrop 2000，美国Thermo Scientific公司)检测RNA的纯度与总量，合格标准为吸光度A260/280≥1.80且RNA总量≥1 μg。琼脂糖凝胶电泳用来检测RNA完整性。

1.3基因芯片检测提取各组织中的总RNA先合成cDNA，并在体外转录成cRNA，既而反转录合成cDNA, 经Nucleospin® Extract Ⅱ试剂盒(MN公司，Cat.No.740609.250)纯化后使用紫外分光光度计定量，然后经荧光染料标记后与 mRNA 表达谱芯片V4.0(GeeDom)进行杂交。基因芯片杂交、清洗和扫描由北京博奥生物有限公司完成。

1.4GO富集和KEGG信号通路分析GO(Gene Ontology)富集分析包括细胞组分、分子功能和生物过程三个独立的分析体系，可以整合生物信息学数据库中的资源。 KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 信号通路和GO分析用来探索差异性表达的基因参与的信号通路及生物过程。Cytoscape V3.2.1软件用来解读差异性基因相关的信号通路及功能，显著性的检验水准为α=0.05。

1.5PPI(Protein-ProteinInteraction)网络分析STRING数据库是检索基因间相互作用的搜索工具，可以提供实验性和预测性的基因之间的相互作用和联系。STRING 10.0版本用于绘制和分析差异性表达基因间的相互作用。

1.6统计学处理Agilent Feature Extraction软件用于处理基因芯片扫描图并得到原始数据，GeneSpring 软件将原始数据进行归一化分析并以Excel格式输出数据。通过SPSS 17.0软件进行双样本T检验，差异表达基因筛选标准为Fold Change(FC，变化倍数)≥2.0且P<0.05；Cluster 3.0软件用于聚类分析，GraphPad Prism 6软件用于图形展示。

2 结果

2.1胃萎缩性炎症恶变过程中基因表达谱的变化为了全面分析胃萎缩性炎恶变至胃癌过程中基因表达谱的变化，本研究收集了5例慢性重度萎缩胃炎伴肠上皮化生组织和5例进展期胃癌组织进行高通量基因芯片检测。转录组基因芯片分析技术显示了萎缩性胃炎组织及胃癌组织中基因表达谱的变化， 共2 779个具有明确注释的基因差异性表达(FC>2且校正后P<0.05认为是具有显著差异性表达)，与萎缩性胃炎组织相比，有1 288个基因在胃癌组织中高表达，1 491个基因在胃癌组织中低表达。火山图可以更加清晰的显示差异性基因的表达情况，绿色表示在萎缩性胃炎组织中低表达的基因，红色表示在萎缩性胃炎组织中高表达的基因，黑色标记的基因表示没有显著性变化的基因，但是它们的变化倍数可能很大，或者P值可能极小，见图1。

图1 全部检测基因火山图差异比较

以变化倍数(fold change ,FC)的log2为横轴，以校正后P值的lg值负数为纵轴，绘制火山图，分析全部检测基因的差异；图中灰色横线是校正后P值=0.05的位置，两条灰色的竖线是FC=2的位置

2.2胃萎缩性炎症恶变过程中变化最显著的基因在基因芯片检测筛选的2 779个差异性表达的基因中，其中在萎缩性炎恶变过程中变化最为显著的基因，如上调的有CXCL1、S100A9、CXCL8、CHI3L1、S100A8、BCL2AL、SAA1、PI3；下调的有DAZ2、DAZ1、GAST、MSMB、C6orf58、DAZL、KCNE2、GIF、ATP4B、KRT20。具体信息见表1。此外，为了更加直观的显示这30个显著差异表达的基因在萎缩性胃炎组织及胃癌组织中的表达水平，使用Cluster 3.0软件进行聚类分析，结果用热图展示，见图2。

图2 热图分析展示

2.3胃萎缩性炎症恶变过程中差异性表达基因的GO富集分析为了探索萎缩性胃炎与胃癌组织中差异性基因表达所代表的生物学功能，对这些基因进行了GO富集分析，GO富集分析是生物信息学研究中非常重要的工具。共筛选出130个富集的生物过程(校正后的P<0.05)及每个生物过程中所包含的差异性表达的基因。其中前10个富集的生物学过程分别是炎症反应、白细胞趋化作用、细胞迁移、血管生成、对细菌来源分子的反应、细胞运动、细胞黏附作用、血管内皮生长因子的调节、趋化因子介导信号通路、脂多糖介导信号通路。图3直观地显示了差异性表达的基因与富集的生物过程的关联程度。

表1 在胃癌组织中变化最明显的15个下调基因和15个上调基因

2.4胃萎缩性炎症恶变过程中KEGG信号通路分析为进一步研究从胃萎缩性炎恶变至胃癌过程中所涉及的信号通路，对异常表达的基因进行了KEGG信号通路分析。结果显示，在KEGG PATHWAY数据库中，以P<0.05为检验标准，共筛选出31条信号通路，其中包括TNF信号通路、NF-kappa B信号通路、化学致癌作用、趋化因子信号通路、NOD样受体信号通路等。图4总结了前15个差异性最为显著的信号通路。

2.5差异性表达基因PPI网络分析为了解差异性表达基因编码蛋白质的功能及蛋白与蛋白之间的功能，将前100名差异性表达最为显著的基因输入STRING 10.0数据库中，绘制PPI网络图(图5)。研究显示，在胃萎缩性炎症恶变至胃癌过程中，差异性表达基因编码的蛋白质CXCL1、PPBP、CCL20、CXCR2、IL8、STT和SAA1关联程度强； IL6、IL11、MMP3、CSF3和OSM之间也具有明显的相互作用。

图3 GO分析显示差异性表达的基因富集最显著的前10个生物过程

图4 在KEGG PATHWAY数据库中差异性表达的基因富集最明显的15条信号通路

图5 PPI网络图

3 讨论

慢性炎症在肿瘤的发生过程中发挥重要作用，研究[4]证明高达25%的恶性肿瘤继发于慢性炎症，例如胃癌。胃癌在我国仍具有相当高的发病率，发病机制不清楚，一般认为在萎缩性胃炎基础上出现肠上皮化生，异型增生，进而发展为胃癌。从萎缩性胃炎恶变至胃癌过程中，分子机制复杂多元，其在遗传和表观遗传改变的积累驱动炎症细胞进行性转化为恶性衍生物成为研究热点。此外，胃癌早期诊断对临床预后起着很重要的作用，通过对胃癌分子机制的研究，探讨胃癌早期诊断显得非常重要。

为了更加全面的了解胃癌的发病机制，本研究收集了萎缩性胃炎和胃癌组织进行基因芯片检测，共筛选出2 779个差异性表达的基因，总结了变化最明显的15个上调基因及15个下调基因。以往的研究已经证明了一些基因在胃癌的发生发展过程中发挥重要作用，例如，基因芯片结果显示在胃癌组织中高表达的CXCL8可以增加慢性炎症恶变至肿瘤的风险，并且可以促进胃癌的增殖和转移[5]。S100A9和S100A8是一类钙结合蛋白，两者在多种肿瘤中高表达，可以激活MMP-2的表达和NF-kappa B 促进胃癌细胞侵袭和迁移的，并且可以作为胃癌临床诊断标志物[6-8]。在胃癌组织中低表达的KCNE2、SOSTDC1、ATP4A和ATP4B均被报道与胃癌的病理机制及临床特征相关[9-11]。这些基因在胃癌中的表达情况与我们基因芯片检测的结果一致，说明它们在胃萎缩性炎症恶变过程中发挥重要作用。

此外，本研究发现了一些在胃癌中未见报道的肿瘤相关基因。基因芯片结果显示CPA2在胃癌组织中低表达，最新的研究证明CPA2缺失与胰腺癌的发生有关[12]；HCAR3的高表达与乳腺癌有关[13]，本研究显示其在胃癌发生过程中上调。BCL2A1是BCL-2蛋白家族成员，调控细胞凋亡，有研究[14]表明它可以作为MYC的靶分子诱导发生白血病B细胞白血病。这些肿瘤相关基因在胃萎缩性炎症恶变过程中差异性表达非常显著，为胃癌发病分子机制的研究指出新的方向。

为了探索差异性表达基因所表示的生理意义，本研究进行了生物信息学分析。GO分析和KEGG信号通路分析分别展示了在胃萎缩性炎症恶变过程中富集的生物过程和信号通路。如CXCL1、CXCL8、CCL20、IL11共同参与炎症反应和趋化因子信号通路， BCL2A1 参与NF-kappa B 信号通路，ATP4A和ATP4B共同参与胃酸分泌。ITGAX参与细胞迁移、黏附和运动。肿瘤发生涉及复杂基因网络的改变，本研究使用了PPI网络分析胃萎缩性炎恶变过程中基因网络的改变，更加清晰地显示基因编码蛋白之间的联系程度。高表达 IL8、CCL2、TNF-α和OSM的胃癌干细胞GC-MSCs的培养液可以活化嗜中性粒细胞，进而激活IL6-STAT3信号途径促进胃癌的迁移[15]，此点在PPI基因网络图谱中得到同样的体现。

本文提供了在胃萎缩性炎症恶变过程中宏观基因表达谱的变化，将为今后的研究提供重要的参考依据。并且这些差异性表达的基因可能与胃癌的发病机制和临床特征相关，但是仍然需要更多的样本和实验进一步验证。