WNT/β-catenin信号通路与EMs侵袭及预后的相关性

张星光，马建婷，傅云雀，傅家欣

(浙江省余姚市人民医院妇产科，浙江余姚315400)

子宫内膜异位症(endometriosis，EMs)是指活性子宫内膜组织种植在子宫腔外所引起的一组症候群，是一种激素依赖性妇科疾病，好发于育龄期妇女[1]，临床多表现为进行性加重的盆腔粘连、疼痛、不孕等症状，并有类似恶性肿瘤种植、向周围组织侵袭及复发的生物学行为，严重影响患病妇女的身心健康和生活质量[2]。EMs的发病率呈逐年上升趋势，发病年龄越来越趋于年轻化[3]。EMs的发病机制目前尚未明确，多以Sampson经血逆流种植学说为主导理论[4]。近年来，Wnt/β-catenin信号通路与EMs疾病发生、发展的相关性已引起学者们的广泛关注[5]。

本研究通过对比EMs患者异位子宫内膜和非EMs患者正常子宫内膜中β-catenin、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、基质金属蛋白酶-9(matrix metallopeptidase 9，MMP-9)和微血管密度(mierovasuclardensvit，MVD)的表达情况，同时结合EMs患者手术前后的血清CA125水平，分析Wnt/β-catenin信号通路在EMs侵袭发生机制中的作用及与疾病复发的相关性，为EMs靶向治疗提供理论基础。

1资料与方法

1.1一般资料

收集2012年7月至2014年12月期间在余姚市人民医院妇产科住院并行手术治疗的EMs患者的异位子宫内膜组织标本100例作为观察组。按照美国生育协会EMs分期标准(r-AFS)[6]进行分期，其中Ⅰ期21例，患者年龄为25～47岁，平均(34.9±5.8)岁；Ⅱ期38例，患者年龄为23～49岁，平均(37.1±6.4)岁；Ⅲ期26例，患者年龄为24～48岁，平均(36.4±5.3)岁；Ⅳ期15例，患者年龄为26～50岁，平均(37.8±7.2)岁。另收集同期因其他妇科良性疾病入院治疗患者的正常子宫内膜组织标本100例作为对照组，患者年龄为25～46岁，平均(37.2±6.1)岁。

所选患者均无其他内外科合并症，且术前3个月内未进行过激素类药物治疗。所收集标本均经病理证实为EMs。两组患者在年龄、妇科合并症、疾病分期等一般资料上比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)，具有可比性。本研究已经医院伦理委员会审查批准，标本提供者已签署知情同意书。

1.2研究方法

1.2.1免疫组化法检测β-catenin、VEGF、MMP-9和MVD在组织标本中的表达强度

对标本进行常规石蜡包埋，行连续切片，厚约4～5μm；组织切片脱蜡、梯度酒精水化；以新配制3%H2O2浸泡20min去除内源性过氧化物酶活性；柠檬酸盐缓冲液抗原修复(pH=6)；滴加5% BSA液封闭15min；滴加1:80稀释的β-catenin、VEGF、MMP-9和MVD一抗，4℃孵育过夜。次日滴加山羊抗兔IgG二抗37℃孵育20min，每步间以PBS冲洗5min×3次，DAB显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，透明，封片。以PBS溶液代替一抗作为阴性对照，以已知高表达组织阳性切片作为阳性对照。显微镜下观察免疫组化切片，以胞核或胞浆出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性。以Image-pro Plus 6.0图像分析软件对镜下染色图片进行分析，病灶区内随机选取5个具有代表意义的高倍视野(×400倍)，取平均光密度值反映β-catenin、VEGF、MMP-9和MVD的阳性表达强度。

1.2.2检测EMs患者手术前后血清CA125的水平

对100例EMs患者手术前后分别于清晨空腹抽取静脉血3mL，室温下静置1h后3 000r/min离心，取上层血清，-80℃保存待用。采用罗氏Cobas-6000生化免疫分析仪，以化学发光法检测血清中CA125的水平，以大于正常参考值35IU/mL为阳性。

1.2.3 EMs患者复发情况

于手术1年后对EMs患者进行随访，记录其复发情况。

1.3统计学方法

2结果

2.1两组免疫组化结果的比较

β-catenin、VEGF、MMP-9和MVD在异位子宫内膜组织和正常子宫内膜组织的腺上皮细胞和间质细胞中均有表达，以腺上皮细胞表达为主，显色为棕黄色或棕褐色，见图1。

观察组β-catenin、VEGF、MMP-9和MVD的平均光密度值均显著高于对照组(t值分别为3.254、5.426、2.537、2.091，均P<0.05)，观察组β-catenin、VEGF、MMP-9和MVD的表达情况与EMs分期均呈显著正相关(r值分别为0.834、0.651、0.588、0.742，均P<0.05)，其表达强度均随着EMs分期增高而增高，见表1。

表1 两组β-catenin、VEGF、MMP-9和MVD的表达及血清CA125水平的比较结果

注：*与对照组相比P<0.05；#与术前相比P<0.05。

2.2 EMs患者异位子宫内膜β-catenin、VEGF、MMP-9、MVD的表达强度与血清CA125水平的相关性

EMs患者术后血清CA125水平显著低于术前水平(t=8.375，P<0.05)，EMs患者手术前、后血清CA125水平均与EMs分期呈显著正相关(r值分别为0.622、0.781，均P<0.05)，其水平均随着EMs分期及β-catenin、VEGF、MMP-9、MVD的表达强度增高而增高，见图1。

注：图A1～A4分别代表观察组的β-catenin、VEGF、MMP-9和MVD；图B1～B4分别代表对照组的β-catenin、VEGF、MMP-9和MVD。

图1典型免疫组化图像

Fig.1 Typical images of immunohistochemical assay

2.3 EMs患者异位子宫内膜β-catenin、VEGF、MMP-9和MVD的表达强度与复发的相关性

手术1年后对EMs患者进行随访，100例EMs患者复发11例，其中Ⅱ期EMs患者复发2例，Ⅲ期复发4例、Ⅳ期复发5例，未见Ⅰ期复发患者，EMs患者复发例数随着分期增高呈现增长趋势，表明β-catenin、VEGF、MMP-9和MVD的表达强度与EMs复发情况呈现一定的正相关性，但由于复发例数较少，每期各指标的表达强度与复发例数的相关性检验差异均无统计学意义(均P>0.05)。

3讨论

3.1 Wnt/β-catenin信号通路与EMs发病的相关性

Wnt/β-catenin信号通路在人类生物学的各个方面都发挥着重要作用。已有研究证明，Wnt/β-catenin信号通路激活与多种肿瘤的发生、发展均有联系，其不仅可调控肿瘤细胞的生长、发育和分化，还可参与肿瘤的侵袭和转移过程[7]。近年来，Wnt/β-catenin信号通路与EMs发病的相关性已引起学者们的广泛关注，其可能在促进异位子宫内膜细胞黏附、侵袭和血管生成过程中起着关键作用[1]。β-catenin是Wnt信号通路的重要调节因子之一，该通路可参与调控细胞的生长与增殖[8]，异位子宫内膜细胞可能存在β-catenin的蓄积现象，当β-catenin高表达时，Wnt信号通路可激活为开放状态，同时可促进其下游因子VEGF和MMP-9的表达，当β-catenin低表达时，Wnt信号通路呈闭合状态，VEGF和MMP-9的表达均显著下降[5，9]。本研究对比分析了EMs患者异位子宫内膜和非EMs患者正常子宫内膜中β-catenin的表达情况，结果显示，β-catenin在异位子宫内膜组织和正常子宫内膜组织腺上皮细胞和间质细胞中均有表达，以腺上皮细胞表达为主。观察组β-catenin的表达强度均显著高于对照组(均P<0.05)，且表达情况与EMs分期呈显著正相关(均P<0.05)。

3.2 VEGF、MMP-9和MVD与EMs发病的相关性

研究发现，EMs患者腹腔内以病灶为中心的放射状血管增生是该病的特征性改变之一，异位子宫内膜中的毛细血管总表面积较正常子宫内膜显著增加，可见，新血管生成现象在EMs的发生、发展中起着一定的作用[10]。VEGF是一种具有高度特异性的血管生成因子，其可直接作用于血管内皮细胞，通过促进血管内皮细胞的有丝分裂、增加血管通透性、促进血管舒张、改善细胞外基质等方式，促进血管内皮细胞的增殖、诱发新生血管形成[11-12]。众多学者研究发现，VEGF及其受体蛋白在EMs患者在位和异位子宫内膜中的水平均明显升高，表明VEGF可能参与了子宫内膜细胞异位种植过程中的血管形成过程[13-14]。MMP-9是MMPs家族中相对分子质量最大的明胶酶，其能降解细胞外基质(extracellular matrix，ECM)中Ⅳ型、Ⅴ型胶原和明胶等主要成分，并能促进血管内皮细胞生长，诱发新生血管生成，同时还可通过与整合素的相互活化而加强细胞间的黏附作用，进而可能在子宫内膜细胞的异位黏附、种植、生长过程中发挥一定作用[15]。此外，MVD是对血管最密集部位进行的微小血管计数，是新生血管生成定量描述的金标准。子宫内膜黏附时，须有新生血管的建立才能维持内膜的生存与发展，内膜组织中MVD越高说明新生毛细血管越丰富，异位子宫内膜本身及其周围组织新的血供的建立和维持是EMs发生的基础条件。

上述重要的细胞因子均可能参与了EMs的发生、发展和转移过程。本研究对比分析EMs患者异位子宫内膜和非EMs患者正常子宫内膜中VEGF、MMP-9和MVD的表达情况，结果显示VEGF、MMP-9和MVD在异位子宫内膜组织和正常子宫内膜组织腺上皮细胞和间质细胞中均有表达，以腺上皮细胞表达为主。观察组VEGF、MMP-9和MVD的表达强度均显著高于对照组(均P<0.05)，且各指标的表达情况与EMs分期均呈显著正相关(均P<0.05)。

3.3血清CA125水平与EMs发病及复发的相关性

EMs是一个激素依赖性疾病，患者接受治疗多以保守手术为主，即只切掉病灶，保留卵巢、子宫、子宫内膜等。由于患者激素依旧处于分泌比较旺盛的阶段，因而较易引起疾病复发，即一段时间后再次出现临床症状，其程度可达到治疗前水平甚至加重，EMs保守术后年复发率可达10%，5年复发率可达20%～40%[16]。CA125是体腔上皮细胞分泌的一种高分子糖蛋白表面抗原，可作为卵巢癌的诊断标记物，近年来也开始用于EMs的诊断、治疗和预后监测，可作为临床上EMs的血清学辅助检测指标[17]。黄蓉等[18]研究发现，CA125与EMs的发生、发展及预后有关，其水平随着EMs分期增加而呈升高趋势。

本研究结合EMs患者手术前后的血清CA125水平、EMs分期及术后复发情况，分析β-catenin、VEGF、MMP-9和MVD的蛋白表达强度与复发的相关性，结果显示，EMs患者术后血清CA125水平显著低于术前水平(P<0.05)，手术前、后血清CA125水平与EMs分期均呈显著正相关(均P<0.05)；手术1年后100例EMs患者复发11例，EMs患者复发例数与EMs分期及β-catenin、VEGF、MMP-9和MVD的表达强度亦呈现一定的正相关性，但由于复发例数较少，相关性检验差异均无统计学意义(均P>0.05)。

综上所述，β-catenin、VEGF、MMP-9和MVD的高表达与EMs发病相关，表明Wnt/β-catenin信号通路对EMs的迁移和侵袭过程有一定的影响，且影响越大，术后疾病的复发可能性越大。