FGR的胎盘组织印记基因PEG10DNA甲基化水平及其意义

梁小妍，金玉珍，马 丽，陈 雄

(上海市第一人民医院宝山分院妇产科，上海200940)

胎儿生长受限(fetal growth restriction，FGR)是围产儿发病和死亡的主要原因之一，其围产儿患病率及死亡率为正常发育儿的4～6倍，不仅影响胎儿的宫内发育，远期也影响儿童期及青春期的体能与智能发育。流行病学调查发现FGR是成人疾病宫内起源的病因之一[1]。引起FGR的原因包括胎儿、胎盘、母体及环境方面的因素。胎盘发育和功能障碍是最常见的引起FGR的原因，但引起FGR胎盘发育和功能障碍的确切机制尚不清楚[2-4]。Diplas等[5]通过分析FGR和正常妊娠胎盘组织中的印迹基因表达，发现被研究的印迹基因中17%(9/52)存在统计意义上的表达差异。这些研究表明印迹基因的表达异常可能是胎盘组织长期血流低灌注的一个原因。印记基因的表达异常与其甲基化水平密切相关，目前关于印记基因PEG10 DNA甲基化水平对FGR的影响研究较少。本研究通过分析印记基因PEG10 DNA在FGR患者胎盘组织的甲基化水平，探讨印记基因的DNA甲基化水平在FGR发病中的作用。

1资料与方法

1.1一般资料

本研究采取前瞻性研究，收集2014年1月至2017年1月在上海市第一人民医院宝山分院妇产科住院分娩FGR者(研究组)56例，FGR患者不论诊断孕周，最终足月待产48例，早产患者8例；同时收集同期住院的正常足月分娩者(对照组)56例为研究对象。所有入选者签署知情同意书，并经我院伦理委员会审查批准。

1.2研究对象纳入标准

所有孕妇均系单胎、月经周期规律、末次月经清楚、排除肝肾功能异常、无妊娠合并症及并发症、无宫缩、剖宫产分娩者。两组孕妇均排除既往不良妊娠史、原发高血压、糖尿病、慢性肾炎、心脏及免疫系统疾病等慢性疾病史。无输血及免疫治疗史。同时所有入选对象均无妊娠合并症。

研究组因在住院监护期间，因胎监异常提前终止妊娠4例(孕34～36周)，羊水急剧减少终止妊娠4例(孕33～36周)。FGR患者的诊断标准参照全国高等学校教材《妇产科学》第8版，其中B超检查胎儿和头围的比值小于同孕周平均值的第10百分位数，考虑可能为FGR。

1.3试验方法

1.3.1标本的选取

所有标本均在胎盘娩出15min内，无菌剪取胎盘脐带根部附着区域母体面中央部位组织3～4块，约1.0cm×1.0cm×1.0cm大小，避开出血、坏死及钙化的区域。用灭菌PBS溶液漂洗干净，其中1块置于经DEPC水处理并消毒的冻存管中，其余全部迅速置于液氮中，过夜后转入-80℃冰箱保存备用。另留取新鲜组织约1.5cm×1.5cm×1.5cm小块置于4%多聚甲醛中固定，用于免疫组化测定。

1.3.2 DNA的提取

按照试剂盒(QIAamp DNAFFPETisue)操作步骤对DNA进行提取。采用紫外分光光度仪检测DNA含量。选取A260nm/A280nm比值为1.8～2.0的标本为研究对象。

1.3.3亚硫酸盐处理及纯化

取基因组DNA 1μg，严格按照Epi Tect Fast DNA Bisulfite Kit(QIAGEN，cat：59824)说明书进行DNA亚硫酸氢盐修饰处理，未甲基化的胞嘧啶经亚硫酸氢盐修饰后变为尿嘧啶，甲基化的胞嘧啶不改变。Meth Primer软件设计其3个CPG岛特有3引物，见表1，引物由上海世济公司合成。PCR扩增总体系50μL，加入经亚硫酸氢盐修饰的DNA模板2μL，2×PCR buffer 25μL，上下游引物各1μL，用双蒸水调整至终体积为50μL。PCR条件及设定反应程序：95℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，运行40个循环；72℃修复延伸5min结束反应。PCR产物以2%琼脂糖凝胶电泳，按照试剂盒(Generay，cat：GK2043)回收目的片段并纯化。

表1印记基因PEG10 CPG岛引物序列

Table 1 Primer sequence of island CPG in imprinted gene PEG10

1.3.4 BSP测序

回收DNA与载体pTG19-T(Generay公司)4℃连接过夜，取10μL连接产物与XL10-Gold感受态细胞冰浴20min，42℃热激45s后，再在冰中放置2min，加入500μL LB培养基，37℃振荡培养60min；在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落，酶切法鉴定阳性菌落。每个挑取10个阳性单克隆质粒送华大基因测序，华大基因测序中心运用BiQ-analyzer软件分析测序结果并绘图。

1.4统计学方法

2结果

2.1两组的临床资料

研究组与对照组的年龄、孕周、孕次及体质量指数比较差异均无统计学意义(均P>0.05)，见表2。

2.2两组胎盘病理形态学改变情况

研究组胎盘不同程度的绒毛发育不良(膜状胎盘及轮廓胎盘各4例)，合体结节增多(5例)，纤维蛋白沉积(14例)，绒毛膜炎(6例)，甚至终末绒毛缺乏(2例)，总体病理学改变发率占62.50%(35/56)，对照组终末绒毛丰富，其中只有8例发生胎盘钙化，病理学改变率仅为14.29%(8/56)，两组比较差异明显，具有统计学意义(χ2=27.52，P<0.05)，见图1。

组别 例数(n)年龄(岁)孕周(周)孕次(次)孕妇分娩前BMI(kg/m2)对照组5627.08±3.0737.67±0.541.56±0.4866.83±4.03研究组5626.80±2.7537.42±0.561.48±0.4266.76±3.82t0.512.410.940.09P0.680.050.360.16

2.3两组胎盘印记基因PEG10 DNA甲基化水平

研究组胎盘组织印记基因PEG10 DNA甲基化水平在CPG岛1无明显差异，而在CPG岛2及CPG岛3明显高于对照组，尤其以CPG岛2最为明显，差异均具有统计学意义(均P<0.05)，见图2、表3。

注：1为正常胎盘组织(HE×20)；2为FGR胎盘组织(HE×20)，箭头所指为纤维蛋白沉积。

图1正常妊娠及FGR患者胎盘组织形态变化

Fig.1 Morphological changes of placental tissue in normal pregnancy and FGR patients

注：A是正常妊娠与FGR胎盘组织CPG岛1的甲基化程度，1为正常妊娠胎盘组织CPG岛1的甲基化程度，2为FGR胎盘组织CPG岛1的甲基化程度；B是正常妊娠与FGR胎盘组织CPG岛2的甲基化程度，1为正常妊娠胎盘组织CPG岛2的甲基化程度，2为FGR胎盘组织CPG岛2的甲基化程度；C是正常妊娠与FGR胎盘组织CPG岛3的甲基化程度，1为正常妊娠胎盘组织CPG岛3的甲基化程度，2为FGR胎盘组织CPG岛3的甲基化程度；每个横向的圆圈串代表一个单克隆测序结果(每个胎盘样品都有10个)，每个圆圈串上21个圆圈代表扩增目的片段上的21个CPG位点，其中实心的圆圈代表该CPG位点上C是甲基化的，空心的圆圈代表该CPG位点上C是未甲基化的。

图2重亚硫酸盐修饰测序(BSP)检测胎盘组织印记基因PEG10 DNA甲基化水平

Fig. 2 Methylation level of imprinted gene PEG10 DNA detected by heavy sulfite-Modified sequencing (BSP) in placenta tissue

组别CPG岛1CPG岛2CPG岛3研究组1×10-3±1×10-30.544±0.0270.245±0.041对照组1×10-3±2×10-30.152±0.0150.287±0.023t0.0294.977.16P0.830.000610.0005

3讨论

3.1 FGR与滋养细胞的关系

影响胎儿生长的因素涉及多个方面，但胎盘因素是最主要因素之一，胎盘供血不足、滋养细胞缺血、缺氧是FGR的病理实质[6]。而具有父系特征的父源性印迹基因的主要功能是促进滋养细胞的增殖分化和浸润[7]；将单性生殖的胚胎移植于子宫，发现单雄生殖的胚胎发育缺陷，胚外细胞系-滋养叶生长过度，浸润能力强，形成胎盘较大。而单雌生殖动物滋养叶、胎盘形成能力不足。这表明父方来源印记基因主要调节滋养叶的生长及胎盘形成[8]。胎盘的早期发育取决于胎盘滋养细胞的浸润和血管的形成[9]，已证实胎盘滋养细胞浸润和迁移异常会导致胎盘发育异常，母婴血流交换下降，诱发FGR。

3.2印记基因PEG10甲基化参与滋养细胞发育

PEG10属于父方表达而母方印记的重要印记基因[10-11]。在前期研究正常妊娠细胞滋养层细胞(cytotrophoblasts，CTB)和绒毛外滋养层细胞(extravillous trophpblast，EVT)基因表达谱(Affymetrix芯片)中发现，有许多基因高表达，PEG10就是其中之一[12]，并且PEG10可能参与子痫前期[13]。而FGR、妊娠期高血压疾病患者的胎盘中存在类似的核心病理变化。基因印记是由DNA甲基化差异标记父本和母本的基因组，DNA甲基化是印记基因表达调控主要机制[14]之一。本研究结果显示FGR患者胎盘病理学改变发生率为62.50%(35/56)，主要表现为不同程度的绒毛发育不良，合体结节增多，纤维蛋白沉积，绒毛膜炎，甚至终末绒毛缺乏。同时，父方表达的印记基因PEG10在FGR患者胎盘组织高度甲基化，而在正常妊娠胎盘组织其甲基化程度明显降低。尤其是以CPG岛2为主的高甲基化。而在本研究结果中显示印记基因PEG10过度甲基化，其主要机制可能是印记基因PEG10过度甲基化，转录活性减弱，蛋白表达降低，从而导致了父方基因对滋养细胞的增殖分化和浸润作用降低，最终导致FGR发生。

综上所述，父方表达印记基因PEG10的甲基化程度可能参与FGR的发生，而其在FGR发病的主要调控是通过其表观遗传修饰甲基化程度来体现。通过上述研究为进一步阐明印记基因在FGR发病中的机制奠定了一定的基础，同时提示表观遗传修饰可能在胚胎发育及其生长中有着不可忽略的作用。