个体化补充叶酸对新生儿出生缺陷的影响

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浙江丽水市妇幼保健院妇产科浙江丽水

出生缺陷是指由于遗传、环境、染色体或基因异常等因素造成胎儿或胚胎在生长发育过程中出现一系列诸如先天性心脏病、唇腭裂、无脑儿或者脊柱裂等结构和功能异常的疾病，其在我国的发生率高达5.6%[1-2]。由于出生缺陷的具体发病机制尚未得到明确，近年来越来越来资料显示出生缺陷与基因多态性关系密切，叶酸代谢相关基因和同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)则最为常见。由于甲硫氨酸合成还原酶(methionine synthase reductase，MTRR)、亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)为叶酸代谢相关基因的关键酶，当MTRR及MTHFR的基因位点多态性改变时可显著增加血清中Hcy的表达水平，目前临床上普遍认为适当补充叶酸水平可显著减少Hcy表达水平，在妊娠期妇女孕前及孕后3个月内则为最佳时机，可显著减少出生缺陷的发生率[3-4]。然而关于叶酸的最佳补充剂量、作用机制尚未得到明确，因此本研究通过丽水市妇幼保健院妇产科2017年11月至2018年5月657例进行孕检的孕妇作为研究对象分析不同叶酸代谢关键酶基因型及个体化补充叶酸对孕妇血清Hcy水平和出生缺陷发生的影响。

1研究对象与方法

1.1研究对象

将浙江丽水市妇幼保健院妇产科2017年11月至2018年5月657例进行孕检的孕妇作为研究对象；年龄为20～35岁，平均为(26.79±3.45)岁。纳入标准：①夫妇双方均无家族遗传性疾病；②夫妇双方均无明显解剖学异常；③夫妇双方心肝肾功能均正常。

1.2方法

1.2.1分组情况

在首次孕检时，对研究对象血清Hcy含量与MTRR A66G和MTHFR A1298C、C677T位点情况进行测定。按照基因检测结果，可将个体对叶酸利用能力风险等级进行划分，分成高度风险、中度风险、低度风险及未发现风险共四等级[5]，见表1。其中，中高度风险共301例(A组)与低度风险+未发现风险共356例(B组)，评估未给予两组孕妇叶酸处理时血清中Hcy的表达水平。其中，A组给予叶酸800μg/d，B组给予叶酸400μg/d，均至孕3个月。记录两组Hcy水平和新生儿出生缺陷情况。

表1叶酸利用能力基因检测风险等级的划分

Table 1 Division of risk level for gene detection of folic acid utilization

1.2.2标本采集及检测

首次孕检时均通过收集两组孕妇的口腔粘膜上皮细胞并通过Taqman-MGB技术行基因检测(MTRR A66G和MTHFR A1298C、C677T多态性)，其中基因检测探针及试剂均由苏州泰通基因检测器械有限公司提供，通过PCR技术对MTRR A66G和MTHFR A1298C、C677T位点行荧光定量测定，其中每个反应体系总体积为10L，于95℃恒温箱反应10min后采用PCR扩增仪于92℃恒温箱反应15s及60℃恒温箱反应60s行20个循环的扩增，后于89℃恒温箱反应15s及60℃恒温箱反应90s行30个循环的扩增。扩增结束后通过PCR扩增仪行荧光定量检测读取出终点荧光并通过相应的分析软件明确各种样本的基因分型。抽出两组孕妇清晨空腹外周静脉血5mL行Hcy表达水平检测。于两组孕妇处于12～13孕周时，再次抽取空腹外周静脉血5mL行Hcy表达水平检测，通过全自动生化分析仪并采用酶循环法检测两组孕妇血清中的Hcy的表达水平。

1.3统计学方法

2结果

2.1孕妇MTRR A66G和MTHFR A1298C、C677T基因分型结果

本研究纳入的657例进行孕检的孕妇的三种基因分型均行Hardy-Weinberg检验，结果均提示P>0.05，由此可大致将本样本以代表本地区全部孕妇。657例进行孕检的孕妇MTRR A66G基因型GG、MTHFR A1298C基因型CC、C677T基因型TT三种纯合突变频率分别为6.39%(42/657)、5.78%(38/657)、26.94%(177/657),见表2。

表2孕妇MTRR A66G和MTHFR A1298C、C677T基因分型结果[n(%)]

Table 2 Genotyping results of MTRR A66G and MTHFR A1298C and C677T in pregnant women[n(%)]

基因基因型结果MTRR A66GAA385(58.60)AG230(35.01)GG42(6.39)MTHFR A1298CAA421(64.08)AC198(30.14)CC38(5.78)MTHFR C677TCC361(54.95)CT119(18.11)TT177(26.94)

2.2两组孕妇补充叶酸前后Hcy表达水平的比较

统计结果显示，个体化补充叶酸前，A组孕妇血清中Hcy的表达水平显著高于B组(P<0.05)；个体化补充叶酸后，两组孕妇血清中Hcy的表达水平提示无显著差异(P>0.05)，见表3。

组别例数(n)补充前(μmol/L)补充后(μmol/L)A组30110.98±2.156.39±1.42B组3568.01±2.056.28±1.43t18.090.99P<0.010.33

2.3补充叶酸前所有孕妇Hcy对叶酸的利用能力ROC曲线分析

以中高度风险表示阳性，以低风险及未发现风险为阴性，绘制个体化补充叶酸前所有孕妇Hcy对叶酸利用能力的ROC曲线，结果显示当血清中Hcy的表达水平超过8.55mol/L时，ROC曲线下面积为0.79，叶酸利用能力中重度风险的特异性及敏感度分别为78.09%、81.06%,见图1。

图1补充叶酸前所有孕妇Hcy对叶酸利用能力的ROC曲线

Fig.1 ROC curve of folic acid utilization of Hcy in pregnant women before folic acid supplementation

2.4两组孕妇出生缺陷情况比较

两组新生儿总出生缺陷率比较无显著差异(P>0.05)，见表4。

表4 两组孕妇出生缺陷情况比较[n(%)]

3讨论

3.1造成高Hcy血症的可能原因

已有文献报道，高Hcy血症是引发新生儿出生缺陷的独立高危因素之一，这是由于Hcy具有较强的细胞毒性可直接影响胎儿的生长发育，造成胎儿畸形、生长发育缓慢甚至是胎死宫中等严重后果[6-7]。造成这样的原因可能是：①血清中Hcy浓度增加使血管内皮细胞受损，同时刺激血小板的增殖，诱导血栓的形成，出现胎盘血管栓塞，从而阻断胎盘帮助胎儿排出代谢产物或给予营养物质；②血清中Hcy浓度增加使机体内的氧自由基及过氧化物分泌升高，导致DNA受损及细胞凋亡；③血清中Hcy浓度增加降低S-腺苷蛋氨酸的分泌，引起DNA低甲基化，导致染色体出现减数不分离现象；④血清中Hcy浓度增加可间接引发神经干细胞凋亡，引起胎儿神经管闭合不全，出现先天性心脏病及神经管畸形的问题[8-9]。

3.2造成高Hcy血症的直接原因

据相关研究报道，孕妇血清中的叶酸不足或相对不足是导致高Hcy血症的一个直接原因[10]。其中，MTRR、MTHFR为叶酸代谢相关基因的关键酶，当这二者出现基因多态性是可显著减少机体内的酶活性，引起血清中的Hcy无法向蛋氨酸内转化出现DNA低甲基化，同时大量的Hcy积聚于血清中，从而出现高Hcy血症。目前临床上主要采用补充叶酸以控制高Hcy血症，其中围孕期(妊娠期妇女孕前及孕后3个月)适量补充叶酸能有效防治出生缺陷已经得到广泛的认可。然而，有文献指出，在不同人群或者不同地区使用补充叶酸以降低高Hcy血症的临床疗效相差较远[11]。据相关研究显示，C677基因中的TT纯合型突变可显著降低酶的活性，可降低至30%，而CT杂合型突变则可使酶的活性减少35%[12]。本研究发现，657例进行孕检的孕妇MTRR A66G基因型GG、MTHFR A1298C基因型CC、C677T基因型TT三种纯合突变频率分别为6.39%(42/657)、5.78%(38/657)、26.94%(177/657)，且具有明显的地域差异，其中我国北方地区TT突变基因显著高于南方地区，与相关参考文献相一致[13]。由此可推测，MTHFR造成的区域分布差异与补充叶酸后预防出生缺陷的效果不一致相关。此结果也很好解释神经管畸形好发于我国北方地区的一定原因。

3.3个性化叶酸治疗高Hcy血症的意义

本研究按照基因测定结果，分为A组(301例)与B组(356例)。其中，A组给予叶酸400g/d，B组给予叶酸800g/d，均至孕3个月，结果发现个体化补充叶酸前，A组孕妇血清中Hcy的表达水平显著高于B组；个体化补充叶酸后，两组孕妇血清中Hcy的表达水平提示无显著差异；两组新生儿出生缺陷提示无显著差异。有文献认为，给予高Hcy血症妇女大剂量的叶酸治疗虽可以控制高Hcy血症，但大剂量的叶酸也会提高妇女排卵的次数，出现多胎妊娠的风险，而且大剂量的叶酸会造成脂类代谢紊乱，导致血糖浓度剧增，提高血脉粥样硬化的发生率[14]。因而本研究认为临床上应该根据患者具体的叶酸利用能力制定个性化的给药方法，降低大剂量叶酸服用带来的毒副作用，提高临床疗效。同时本研究以中高度风险表示阳性，以低风险及未发现风险为阴性作出补充叶酸前个体化补充叶酸前所有孕妇Hcy对叶酸的利用能力ROC曲线，结果显示当血清中Hcy的表达水平超过8.55mol/L时，提示叶酸利用能力中重度风险的特异性及敏感度分别为78.09%、81.06%。可见对于基层医院采用Hcy以评估叶酸的利用能力并指导治疗具有深刻的意义。

综上所述，不同叶酸代谢关键酶基因型及孕妇血清Hcy检测有利于为不同孕妇提供个体化补充叶酸治疗，减少出生缺陷的发生率。但本研究尚存在一定不足，如未能检测叶酸水平变化及膳食调查，文中仅采用Hcy作为单一评估指标，而对反映叶酸代谢及正常值水平的多项指标仍需今后进一步拓展。