胱硫醚-β-合成酶参与慢性压迫性损伤大鼠神经病理性痛的作用

李清梅 张琴 秦榜勇 代韵柯 李雪

遵义医学院附属医院麻醉科（贵州遵义563000）

外周神经损伤后的神经病理性疼痛是临床上常见的疼痛。以往研究均表明背根神经节（dorsal root ganglia，DRG）对疼痛刺激产生兴奋信号，再将信号传入中枢神经系统致疼痛的增敏反应［1-2］，是痛觉信号传入的初级神经元。硫化氢（H2S）是一种具有神经活性物质的气体信号分子，内源性H2S合成酶胱硫醚-β-合成酶（CBS）广泛参与慢性内脏痛、炎症以及神经病理性疼痛的过程［3-5］。核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）广泛存在于神经细胞和神经胶质细胞，是多种基因表达调控的关键性转录因子，在神经病理性疼痛中也起着重要的作用［6-7］。但在慢性神经损伤过程中CBS如何参与神经病理性疼痛及其与NF-κB的关系，报道较少。笔者拟通过观察CBS抑制剂AOAA对CCI模型大鼠背根节CBS、NF-κB蛋白表达的影响，探讨慢性坐骨神经损伤CCI模型中背根神经节CBS的作用及其与NF-κB的关系。

1 材料与方法

1.1 动物分组成功鞘内置管的雄性SD大鼠36只，体质量180～200 g，5～6周龄，本实验严格按照国家疼痛学会伦理纲要进行操作。采用随机数字表法分为3组（n=12）：CBS抑制剂AOAA组（CCI+AOAA组）、神经病理性痛组（CCI组）及假手术组（Sham组）。术后1 d开始连续给药连续14 d（1次/d），同一时间给药，CCI+AOAA组鞘内注射CBS抑制剂AOAA（Sigma公司）10 μg/kg 10 μL+ 生理盐水10 μL，CCI组鞘内注射等量的生理盐水。

1.2 鞘内置管腹腔注射水合氯醛（300 mg/kg）麻醉，固定，备皮，消毒，沿L5-6间隙作约2 cm长的切口，充分暴露棘突间隙，将无菌的PE-10导管经棘突间隙向头端置入2 ～ 3 cm，参照文献［8］，脑脊液溢出后封闭导管，固定在颈背后皮下，缝合伤口。

1.3 建立大鼠神经病理性痛模型建立大鼠神经病理性痛模型参照文献［9］。麻醉固定后，暴露股骨后右侧坐骨神经干，间隔1 mm松扎4处，结扎强度以引起小腿肌肉微颤为宜。

1.4 痛阈的测定于术前1 d和术后1、3、7、10、14 d鞘内给药后30 min时随机取6只大鼠测定。热痛阈（TWL）：TF2-光热测痛仪测定。机械痛阈：2390系列电子von Frey测定。

1.5 Westernblot法检测脊髓背根神经节CBS和NF⁃κBp65的表达水平 取出术侧L4～6背根神经节组织，立即放入液氮中冷冻保存，检测蛋白表达水平。

1.6 统计学方法SPSS 19.0软件分析，计量资料正态分布的以（）表示，采用单因素方差分析组间比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 机械痛、热痛阈值比较与Sham组比较，CCI组术后各时点热痛阈缩短，机械痛阈降低（P＜0.05）；与CCI组比较，CCI+AOAA组术后各时点热痛阈延长、机械痛阈升高（P＜0.05）（表1、2，图1、2）。

表1 各组大鼠热痛阈不同时点的比较（n=6）Tab.1 Comparison of thermal withdraw latency of rats at different time in every group x±s

表1 各组大鼠热痛阈不同时点的比较（n=6）Tab.1 Comparison of thermal withdraw latency of rats at different time in every group x±s

注：与Sham组相比，#P＜0.05；与CCI组相比，*P＜0.05

组别Sham组CCI组CCI+AOAA组术前1 d 24.0±2.4 24.1±1.9 24.1±1.9术后1 d 23.9±2.0 11.4±1.8#15.7±1.3*术后3 d 24.1±1.7 11.9±1.9#18.0±2.1*术后7 d 24.2±1.7 12.4±1.1#19.4±1.6*术后10 d 24.2±1.7 12.4±1.1#19.4±1.5*术后14 d 24.2±1.8 11.8±1.8#19.5±1.4*

表2 3组大鼠机械痛阈不同时点的比较（n=6）Tab.2 Comparison of mechanical withdrawal threshold of rats at different time in three group x±s

表2 3组大鼠机械痛阈不同时点的比较（n=6）Tab.2 Comparison of mechanical withdrawal threshold of rats at different time in three group x±s

注：与Sham组相比，#P＜0.05；与CCI组相比，*P＜0.05

组别Sham组CCI组CCI+AOAA组术前1 d 33.7±1.2 33.5±1.4 33.5±2.7术后1 d 33.9±2.1 19.8±1.4#24.2±2.6*术后3 d 33.6±2.4 18.3±1.2#23.8±3.2*术后7 d 33.7±2.3 17.7±2.1#24.6±2.2*术后10 d 33.3±1.9 18.0±2.0#25.9±1.8*术后14 d 35.2±1.2 13.9±3.2#26.2±2.1*

2.2 背根神经节CBS和NF⁃κBp65的表达 与Sham组比较，CCI组术后7和14 d时CBS及NF-κB p65表达上调（P＜0.05）；与CCI组比较，CCI+AOAA组术后7和14 d时NF-κB p65及CBS表达均下调（P＜ 0.05）（表3、图3）。

3 讨论

神经病理性疼痛临床表现为异常痛，痛觉过敏和自发痛等，其发病机制不清。CCI模型是一种经典的疼痛模型，可产生明显的机械异常痛和热痛敏［10］。本研究中CCI大鼠均表现出明显的机械阈值和热刺激阈值降低，提示CCI大鼠模型制备成功。

图1 大鼠热缩足潜伏期阈值不同时间点的变化（n=6）Fig.1 Comparison of thermal withdraw latency of rats at different time

表3 各组大鼠背根神经节NF-κB p65和CBS表达的比较（n=6）Tab.3 Comparison of the expression of CBS and NF-κB p65 in rat dorsal root ganglia at different time in every group x±s

表3 各组大鼠背根神经节NF-κB p65和CBS表达的比较（n=6）Tab.3 Comparison of the expression of CBS and NF-κB p65 in rat dorsal root ganglia at different time in every group x±s

注：与Sham组比较，#P＜0.05；与CCI组比较，*P＜0.05

组别Sham组CCI组CCI+AOAA组CBS术后7 d 0.457±0.222 0.775±0.051#0.425±0.061*术后14 d 0.536±0.044 0.703±0.067#0.349±0.084*NF-κBp65术后7 d 0.517±0.041 0.830±0.046#0.405±0.028*术后14 d 0.549±0.083 0.745±0.054#0.264±0.056*

图3 鞘内注射AOAA对CCI大鼠脊髓背根神经节CBS及NF-κBp65表达影响Fig.3 Western Blot showed the expression of CBS and NF-κB p65 in rat dorsal root ganglia at different time in three group

图2 大鼠机械缩足阈值不同时间点的变化（n=6）Fig.2 Comparison of mechanical withdrawal threshold of rats at different time in three group.

H2S是一种无色、具有臭鸡蛋气味的有毒气体，内源性H2S合成酶CBS大多表达在背根神经节、脊髓、大脑等神经组织中［11-12］。研究报道CBS的上调在慢性疼痛所致的痛觉过敏中起着重要作用［13-15］。本研究结果表明，CCI组背根神经节CBS的表达较Sham组上调，鞘内注射CBS抑制剂AOAA可减轻大鼠神经病理性痛，提示CBS参与了大鼠神经病理性痛的形成和维持。

NF-κB是位于细胞质中以p50/p65异二聚体为形式的一种快反应转录因子，与抑制性蛋白（inhibitor kappa B，IkB）结合而呈非活性状态，被激活后，IkB解离，暴露出p50亚基上的易位信号和p65亚基上的DNA结合位点，使异二聚物表现出NF-κB的活性，被认为是控制早期基因表达的基因开关。本实验给予鞘内注射AOAA后，CCI术后各时点TWL及MWT升高，术后7和14 d时NF-κB p65表达下调，提示大鼠神经病理性痛形成与背根神经节CBS的上调，进一步促进了NF-κB活化。这可能与CCI模型中DRG细胞中H2S产生增加，进一步增加细胞内氧化还原状态来激活NF-κB，增强了的NF-κB活化［16］有关，从而参与神经病理性疼痛的形成。

综上所述，大鼠神经病理性痛形成与背根神经节CBS的表达上调，促进NF-κB活化有关。特异性阻断CBS信号通路和以NF-κB为靶点的治疗可能为慢性疼痛的治疗提供新的思路。