聚丙烯腈膜固定化海藻糖合成酶的研究

娄倩芳 ，李由然 ，石贵阳 *

（1.粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江南大学，江苏 无锡214122；2.江南大学 生物工程学院，江苏 无锡214122）

海藻糖，是由两个吡喃型葡萄糖单体通过α，α-1，-1糖苷键连结而成的非还原型二糖，分子式为C12O22H11。广泛存在于细菌、霉菌、藻类、酵母、低等植物以及一些无脊椎动物等[1]，具有独特的生物抗逆保护作用以及低甜度、非还原性等，在分子生物学、食品、化妆品、医药行业等各个领域应用广泛[2-8]。

海藻糖生产方法主要有化学合成法、微生物抽提法、微生物发酵法、酶法等[4]，其中双酶法生产海藻糖是目前工业化生产海藻糖的主要方法。但存在酶需要精制、反应中间产物多、产物分离提取过程复杂等问题，而海藻糖合成酶能够以廉价的麦芽糖为底物一步生成海藻糖，工艺简单、底物价廉、易于调控等特性，是工业化生产海藻糖的可行性方案。但是，依然存在酶制备工艺复杂、游离酶稳定性差、不能重复利用、与底物分离困难等不足，可以结合固定化技术解决这些问题。目前国内外固定化海藻糖合成酶的报道中，以介孔分子筛[9]、细菌纤维素[10]、壳聚糖[11]、磁性 Fe3O4纳米材料[12]、Eupergit C250L 为载体[13]、多孔聚苯乙烯离子交换树脂[14]为载体进行海藻糖合成酶的固定化研究，解决了固定化酶操作稳定性、转化率等问题，但依然存在固定化酶制备周期长、方法重复性差以及副产物含量高等问题。

聚丙烯腈（Polyacrylonitrile PAN）是指由85%以上丙烯腈与第二、第三单体聚合而成的高聚物[15]，具有易成膜、抗菌性、成本低以及良好的物理化学稳定性等优点，常用作工业化生产分离膜材料。同时，利用聚丙烯腈纤维上的多孔性以及弱酸性基团如羧酸根、磺酸根等[16]可以进行吸附染色。本实验参考聚丙烯腈纤维吸附染色原理，以聚丙烯腈膜为载体，旨在以成本低、操作简便、无污染的固定化方法和材料，获得具有良好酶学特性的固定化酶，同时探讨固定化酶反应中副产物葡萄糖含量的变化，为海藻糖合成酶新固定化材料提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种E.coliBL21（DE3）/pET-28a（+）-TreS：由本实验室构建。

1.1.2 主要试剂聚丙烯腈粉末：上海金山石化公司；N，N-二甲基甲酰胺、聚乙二醇（PEG-400）、十二水合磷酸氢二钠、一水合柠檬酸、海藻糖、麦芽糖、葡萄糖（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；乙腈（色谱纯）：Sigma—Aldrich 公司。

1.1.3 培养基TB培养基：蛋白胨 12 g，酵母粉 24 g、K2HPO412.54 g、K2HPO42.31 g，甘油 5 g，去离子水定容到1 L。

1.2 仪器与设备

台式高速冷冻离心机，Hitachi公司；Sonic VCX-750超声波细胞破碎仪，南京新晨生物科技有限公司；紫外-可见光分光光度计V-1200，上海美谱达仪器有限公司；AL104分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；高效液相色谱系统及工作站，DIONEX公司。

1.3 方法

1.3.1 PAN膜制备在250mL蓝盖瓶中加入55 mL二甲基甲酰胺、5 mL聚乙二醇400，轻轻混匀，加入聚丙烯腈粉末10 g，搅拌均匀，加盖子拧紧，放置65℃烘箱中反应，48 h后，观察成黄色均匀粘稠液体。于室温下放置24 h，除去气泡。倒入具有0.44 mm深度槽的玻璃板上，用玻璃棒刮膜，并立即将玻璃板放入去离子水中，形成薄膜后，将薄膜放置于新的去离子水中24 h以上，中间换3次水，即得聚丙烯腈膜材料。

1.3.2 游离酶液制备将菌种接种到30 mL TB培养基中，37℃、200 r/min摇瓶至 OD600值为 0.6，加入诱导剂IPTG至终浓度为1 mmol/L于25℃、200 r/min条件下发酵18 h。所得发酵液8 000 r/min离心5 min收集菌体，用磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液清洗后重悬，超声破碎制备粗酶液，超声后酶液离心取上清，即得海藻糖合成酶液。

1.3.3 海藻糖合成酶固定化取制备好的PAN膜于烧杯中，加入去离子水超声处理（功率：100 W，频率：40 kHz）20 min 后，去除表面水分，取 30 cm2面积的膜，裁剪为0.5 cm2面积，放置于50 mL离心管中，加入3 mL磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液制备的海藻糖合成酶液（蛋白浓度：1.85 mg/mL），在25℃水浴中吸附反应3 h后，用磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液清洗载体，除去表面附着的游离酶，离心、抽滤即得固定化海藻糖合成酶膜。

1.3.4 海藻糖、麦芽糖、葡萄糖标准曲线制作高效液相色谱法分析海藻糖含量：色谱柱为XBridge Amide 氨基柱（5 μm×250 mm×4.6 mm），视差检测器，流动相为乙腈∶水=80∶20，流速 1.0 mL/min，进样量20 μL，柱温为37℃，根据海藻糖标准曲线，求出样品中海藻糖的含量。

1.3.5 蛋白含量与酶活测定采用考马斯亮蓝法测蛋白含量[17]。

固定化蛋白量（mg）=加入总蛋白量（mg）-清洗液上清中蛋白量（mg）。

固定化蛋白率（%）=负载蛋白量（mg）/加入总蛋白量（mg）×100%。

游离酶酶活测定：取制备的游离酶液稀释一定的倍数后，取1 mL于50 mL离心管中，加入8 mL 5%的麦芽糖底物，30℃条件下反应12 h，沸水浴煮沸10 min终止反应，离心、过膜后，采用高效液相色谱（HPLC）法测定反应液中海藻糖含量。

固定化酶酶活测定：取一份固定化酶，加入8 mL一定浓度的麦芽糖底物，在一定温度下反应12 h，沸水浴煮沸10 min终止反应，离心过膜后，采用HPLC法测定反应液中海藻糖含量。

酶活单位定义：在以上反应条件下每分钟生成1 μmol海藻糖为一个单位酶活。

比酶活：反应总的酶活与酶总蛋白含量的比值。

相对酶活定义：以反应条件中酶活最大的反应为100%，计算其余反应酶活相对百分比。

相对比酶活定义：以反应条件中比酶活最大的反应为100%，计算其余反应比酶活相对百分比。

酶活回收率定义：固定化酶总活力/加入酶的总活力×100%。

1.3.6 固定化条件优化方法取30 cm2面积的膜，裁剪为0.5 cm2面积，放置于50 mL离心管中，依次考察在：pH 5.4～8.0的酶液 （蛋白浓度：1.85 mg/mL），10～45 ℃震荡水浴， 吸附反应时间 0.5～5.0 h、给酶量0.04～0.42 mg/cm2等不同条件，测量固定化蛋白量和固定化酶总酶活，考察pH对固定化效果的影响，选择最佳固定化pH、温度、吸附时间、给酶量。

1.3.7 固定化酶学性质分析方法在最佳固定化条件下制备固定化酶，取相同面积的固定化酶膜以及相同蛋白含量的游离酶，依次考察在：pH 5.4～8.0的5%（w/v）麦芽糖底物、20～60℃、麦芽糖底物质量浓度 50～350 g/L 以及 Cu2+、Co2+、Zn2+、Ni2+、Al3+、Ca2+、Ba2+、Mg2+、Fe2+、Mn2+等不同金属离子溶液的条件下的总酶活，分析固定化酶最适反应pH、温度、初始底物浓度、抑制剂和激活剂等酶学特性。

2 结果与讨论

2.1 固定化条件对固定化效果的影响

2.1.1 酶固定化过程pH对固定化效果的影响取pH 5.4～8.0磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液制备的酶液（蛋白浓度：1.85 mg/mL），在25℃震荡水浴锅中吸附反应3 h，考察pH对固定化酶活性的影响，结果见图1。

由图1所示，随着pH值的升高，固定化酶活性逐渐升高，在pH 7.6时酶活最高；比酶活在pH 7.4后急剧下降。由于PAN材料上带有弱酸性基团，pH较低时影响弱酸性基团的电离，所以，偏碱性的环境有利于酶分子中氨基与PAN载体上的羧酸基结合，因此选择最佳固定化反应pH为7.6。

图1 酶固定化过程pH对固定化效果的影响Fig.1 Effect of immobilized pH on immobilized enzyme

2.1.2 固定化温度对固定化酶酶活的影响取相同的PAN膜载体在pH 7.6条件下，分别在10、25、30、35、40、45 ℃震荡反应 3 h，制备固定化酶，测定固定化反应温度对固定化酶的影响，结果见图2。

如图2所示，随着固定化温度的升高，固定化酶酶活逐渐升高，在35℃时酶活性最高，随着温度的继续升高固定化酶酶活性急剧下降；固定化酶比酶活随着温度的升高先升高后急剧下降，在30℃时比酶活达到最大。由此可知，随着温度的升高，偶联到载体上的蛋白含量增多，同时由于游离酶对温度的敏感性，温度的改变使酶的空间构象发生变化，导致酶活性的变化。因此，综合考虑，选择30℃作为固定化温度。

图2 固定化温度对固定化酶的影响Fig. 2 Influence of immobilized temperature to immobilized enzyme

2.1.3 固定化时间对固定化酶活的影响取相同膜面积PAN载体，在pH 7.6、温度30℃条件下，加入3 mL酶液，在相同条件下分别固定化0.5～5.0 h，通过测量不同不固定化时间条件的见固定化蛋白量和固定化酶总酶活，考察固定化时间对固定化酶的影响，结果见图3。

如图3所示，随着固定化时间的延长，固定化酶活逐渐增加，并逐渐平稳；而相对比酶活先增加后逐渐降低，由此可知，随着固定化时间的延长，载酶量逐渐增加，酶活趋于稳定，说明酶分子开始从表层扩散进入载体空隙内，但有效酶仅与载体表面积有关。因此，选择固定化时间为3.0 h。

图3 固定化时间对固定化酶的影响Fig.3 Influence of immobilized time to immobilized enzyme

2.1.4 固定化加酶量对固定化酶活的影响取相同膜面积PAN载体，在pH 7.6、温度30℃条件下，分别加入0.04～0.42 mg/cm2的酶液，固定化反应3 h，考察加酶量对固定化酶的影响，结果见图4。

如图4所示，随着加酶量的逐渐增大，固定化酶活逐渐增大最后基本不变，而相对比酶活呈逐渐下降的趋势，由此可知，固定化酶有效载酶量仅与膜表面积有关。因此，选择最适加酶量为0.1 mg/cm2。

图4 固定化加酶量对固定化酶的影响Fig.4 Influence of enzyme dosage to immobilized enzyme

2.2 固定化酶酶学性质分析

由以上实验可知，最佳固定化条件为pH 7.6、温度30℃、时间3 h、加酶量0.1 mg/cm2。

2.2.1 固定化酶最适反应pH在最佳固定化条件下制备固定化酶以及取相同偶联蛋白含量的游离酶，分别加入不同pH缓冲液配制的底物，在25℃条件下反应12 h，采用HPLC法测定酶活。结果如图5所示，固定化酶最适反应pH 7.4，与游离酶相比，固定化酶pH稳定性在pH 5.4～8.2范围均保持良好的稳定性，说明经过固定化后，使得酶活性中心对环境pH的敏感性变弱，酶分子更加稳定。

图5 固定化酶与游离酶最适反应pH探讨Fig.5 Research on the optimal reaction pH of the immobilized enzyme and the free enzyme

2.2.2 固定化酶最适反应温度在最佳固定化条件下制备固定化酶以及取相同偶联蛋白含量的游离酶，分别加入pH 7.4缓冲液配制的麦芽糖底物，分别在20～60℃之间反应12 h，采用HPLC法测定酶活。结果如图6所示，固定化酶最适反应温度为40℃，且在25～45℃范围内均保持较高的酶活，相对于游离酶最适温度30℃，最适温度提高了10℃，且在50、60℃比游离酶耐热性高，经过固定化后，酶的热稳定性得到提高。

图6 固定化酶与游离酶最适反应温度探讨Fig.6 Research on the optimal reaction temperature of the immobilized enzyme and the free enzyme

2.2.3 固定化酶反应最适初始底物浓度在最佳固定化条件下制备固定化酶以及取相同固定化蛋白含量的游离酶，分别加入pH 7.4与pH7.0缓冲液配制的质量浓度为50～350 g/L梯度的麦芽糖底物，在40℃反应12 h，采用HPLC法测定酶活，结果如图7所示。由图7可知，固定化酶最适初始底物浓度为200 g/L，伴随着底物浓度的升高，有略微的下降，推测，由于酶被固定在载体上，且底物浓度越高，底物流动性越差，从而影响固定化酶酶反应进程，游离酶最适初始底物浓度为25%，与文献[18]的结果基本一致，说明采用聚丙烯腈膜为载体，传质阻力较小。

2.2.4 固定化酶稳定性在最佳固定化条件下制备固定化海藻糖合成酶，在pH 7.4、40℃、麦芽糖质量浓度200 g/L的条件下反应12 h，反应结束后，取出反应液煮沸10 min，用HPLC法测反应总酶活，将载体用pH 7.4的缓冲液进行清洗，除去表面水分，重复上述操作共15次，考察固定化酶的重复稳定性，结果见图8。

图7 固定化酶与游离酶最适初始底物浓度探讨Fig.7 Research on the optimalinitialsubstrate concentration of the immobilized enzyme and the free enzyme

结果如图8所示，固定化酶随着使用次数的增多，酶活逐渐下降，在最适反应温度40℃条件下使用6次后，固定化酶活仍保持初始酶活的64.4%。

图8 固定化酶40℃反应条件下重复使用稳定性探讨Fig.8 Research on the stability of immobilized enzyme reaction repeated use under 40℃

2.2.5 金属离子对固定化酶的影响在最佳固定化条件下制备固定化酶，同时相同固定化酶含量的海藻糖合成酶酶液，分别加入200 g/L pH 7.4麦芽糖底物和25%pH 6.6麦芽糖底物，以及配制的10 mmol/L 浓度的 Cu2+、Co2+、Zn2+、Ni2+、Al3+、Ca2+、Ba2+、Mg2+、Fe2+、Mn2+溶液，使得金属离子终浓度为0.4 mmol/L，固定化酶与游离酶分别在40、30℃条件下反应12 h，用HPLC法测定酶活，以不加入金属离子的反应为空白对照。结果如图9所示。

结果表明，对于游离酶而言，Ni2+具有激活作用，Cu2+、Fe2+、Co2+均具有轻微的抑制作用，其余的金属离子基本无影响；对于固定化酶而言，仅Cu2+均具有轻微的抑制作用，Ca2+、Zn2+具有激活作用，而其余的金属离子对酶活基本无影响。说明固定化后酶的空间构象发生改变，金属离子对酶的作用发生变化，固定化后提高了酶的稳定性。

图9 金属离子对固定化酶以及游离酶的影响Fig.9 Influence of metal ions of immobilized enzyme and free enzyme

2.2.6 固定化效率取一定面积的PAN载体，在最佳固定化条件下制备固定化酶，计算蛋白偶联率，并在最适反应条件下反应12 h；同时取进行固定化的等量游离酶液在pH 6.6、温度30℃、初始底物浓度250 g/L的最适反应条件下反应12 h，采用HPLC法进行海藻糖含量的测定。经过3次平行实验，蛋白负载率平均70.09%，而酶活回收率仅为50.21%，推测有3种可能性：①所接入的蛋白超过膜面积应接入的有效蛋白；②固定化载体负载上的蛋白部分失活；③负载的蛋白中，杂蛋白的比例高于游离酶液中的比例。

表1 固定化效率Table 1 Immobilization efficiency %

2.2.7 固定化酶与游离酶反应进程在最佳固定化条件下，分别制备相同的固定化酶膜，加入8 mL 200 g/L浓度的麦芽糖底物，在40℃、pH 7.4条件分别反应4～70 h；同时，取相同蛋白含量的游离酶液，加入8 mL质量浓度为250 g/L的麦芽糖底物，在30℃、pH 6.6条件分别反应4～70 h，取固定化酶和游离酶不同反应时间的反应液，沸水浴10 min，离心、过膜，用HPLC法测不同反应时间各个成分的含量。结果如图10所示。

结果表明，对于固定化酶、游离酶而言，随着反应时间的进行，海藻糖含量逐渐升高，伴随着麦芽糖含量的降低以及副产物葡萄糖的增加，最终基本趋于稳定状态；相比之下，经过固定化后的海藻糖合成酶，海藻糖含量变化趋势较游离酶的缓慢，同时副产物葡萄糖的含量较游离酶而言减少近6%左右，说明，经过固定化后的海藻糖合成酶，相对于游离酶，与底物的亲和力受到影响，但相对于游离酶结构状态更为稳定，副产物葡萄糖含量减少。

图10 固定化酶与游离酶反应进程曲线Fig.10 Reaction process curve of immobilized enzyme and free enzyme

3 结语

实验表明，以PAN为载体进行海藻糖合成酶固定化，在pH 7.6、温度30℃，加酶量0.1 mg/cm2条件下固定化3 h，即可制备固定化海藻糖合成酶膜，与文献[9-14]的海藻糖合成酶的固定化而言，载体材料制备方法简单、操作容易、易于控制、成本低、可规模化生产，且固定化条件简单、时间短、无污染等，同时，海藻糖合成酶固定化时使用粗酶液即可，无需纯化。

根据研究表明，游离酶在pH 6.0～7.0、温度25～40℃较稳定，而固定化海藻糖合成酶在pH 5.4～8.0、20～50℃范围内均保持良好的稳定性，固定化酶具有更好的耐热性和酸碱稳定性；40℃条件下，固定化酶重复使用6次后保持初始酶活的64.4%，具有良好的操作稳定性；固定化酶反应达到平衡后，反应液中副产物葡萄糖的含量仅为9.1%并呈现稳定状态，文献[13]的固定化酶相比，副产物含量降低约23%，同游离酶相比降低6个百分点，固定化后海藻糖合成酶更加稳定；固定化海藻糖合成酶与游离酶最适初始底物浓度分别为200 g/L与250 g/L，酶固定在载体上后，与底物之间的亲和性相对于游离酶而言仍有一定的局限性，但相对于采用颗粒状载体而言，以膜的形式进行酶的固定化，在很大程度上降低了载体对传质的影响。

因此，以PAN作为载体为海藻糖合酶固定化具有很好的应用价值，为海藻糖合成酶的固定化研究提供实验依据并拓展了PAN载体在酶固定化中的应用。