基于2-酮基-D-葡萄糖酸高产的发酵条件优化研究

罗秋玲，刘 佳，张 权，杨 彬，陈修来，刘立明

（江南大学 食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122）

2-酮基-D-葡萄糖酸 （2-Keto-D-gluconic Acid，2-KGA），属于有机酸，是大宗生产产品，其主要应用于D-异抗坏血酸钠 （sodium erthorbate，EN）以及 D-抗坏血酸（Erthorbate acid，EA）的合成，D-异抗坏血酸又称异维生素C，在食品工业上被广泛用为食品抗氧化剂[1]。目前，2-KGA的生产方法主要有酶法、化学合成法和发酵法，与其他方法相比，微生物发酵法生产2-KGA原料来源丰富、条件温和、产品安全性好、视为纯天然，从而是最具有竞争力的生产方法。

在自然界中，有许多微生物能发酵生产2-KGA，主要包括沙雷氏菌属、假单胞菌属和产碱杆菌属[2]等。其中，因荧光假单胞菌易培养、发酵效价高等优点而被用作国内工业化发酵生产的菌株。但发酵过程中仍存在一些弊端：1）培养基氮源使用昂贵的有机氮源，蛋白胨、酵母膏等；2）发酵产物成分复杂，不利于下游提取等；3）灭菌不彻底易引发噬菌体污染。虽然可以通过筛选抗噬菌体菌株[3-4]、并采用发酵优化及固定化方式来降低噬菌体感染、提高发酵效价、降低下游提取难度，但仍避免不了噬菌体感染问题[5-7]。因此，筛选一株以无机氮为氮源的2-KGA生产菌株对工业化生产2-KGA以及扩大其在食品、化工及医药等领域的应用具有重要作用。

目前，国内工业化发酵生产2-KGA过程中使用无机氮源的报道较少。本研究以硫酸铵作为唯一氮源的沙雷氏菌属Serratiasp.FMME043为出发菌株[8]，通过在30 L发酵罐上调控发酵补料和溶氧策略提高2-酮基-D-葡萄糖酸的产量，结果表明通过优化促进了葡萄糖向2-KGA转化、提高了2-KGA的产量和生产强度，进而有效地降低了生产成本、分离纯化难度以及噬菌体污染的风险，为后期放大实验和工业化发酵生产提供了基础。

1 材料与方法

1.1 实验菌种

菌种为沙雷氏菌Serratiasp.FMME043，由实验室筛选保藏。

1.2 主要试剂与设备

2-酮基-D-葡萄糖酸钙 （Sigma），Agilent 1200高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），Bio Flo 115型30 L全自动搅拌式发酵罐 （瑞士Infors），UVmini-1240分光光度计（日本岛津公司）。

1.3 培养基

斜面培养基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠10，琼脂0.2，pH 7.0。121℃灭菌15 min。

种子培养基 （g/L）：蛋白胨5，牛肉浸取物3，NaCl 5，pH 7.0，121 ℃灭菌 15 min。

发酵培养基（g/L）：初始葡萄糖100，初始硫酸铵浓度为 5，KH2PO41，Na2SO40.5，MgSO4·7H2O 0.8，MnCl2·4H2O 0.036，FeSO4·7H2O 0.036。 葡萄糖和硫酸铵分别单独115℃灭菌15 min。

1.4 培养条件

斜面培养：将活化的保藏菌种接至斜面培养基上，在30℃培养箱中培养20 h。

种子培养：用接种针从斜面上挑取3～4环菌，接入种子培养基中（50 mL/500 mL），在30℃、200 r/min转速下的摇床中培养12～14 h。

30 L发酵罐培养：30 L发酵罐中初始装培养基16 L，温度30℃，接种量13%，自动流加8 mol/L NaOH控制pH值在6.0。初始搅拌转速500 r/min，通气量24.0 L/min，随着发酵的进行，DO由100%逐渐降低，当降到40%时，关联转速使DO维持在40%左右。发酵过程中每隔4 h取一次样，并测定菌浓OD600、底物葡萄糖和产物2-KGA。

1.5 葡萄糖及2-KGA产物的检测

取发酵液12 000 r/min离心5～10 min，收集上清液并稀释相应倍数，用高效液相色谱 （HPLC）分析。HPLC条件见文献[8]。

发酵生产2-KGA的糖酸转化率计算为

2 结果与讨论

2.1 葡萄糖补料方式对发酵的影响

在发酵生产2-KGA的过程中，若一次性投入过高浓度的葡萄糖等营养物质，会生成并积累大量的代谢副产物，并降低单位细胞转化2-KGA能力；通过补料降低初始发酵培养基的黏度，可有效促进细胞对环境氧和营养成分的充分利用，并解除底物的抑制作用。此外，前期的摇瓶实验发现，发酵初期葡萄糖浓度越低，生产2-酮基-D-葡萄糖酸生产强度越高[8]。

以前期实验为基础，在种子和发酵条件以及补料液相同的条件下，考察了发酵培养基的葡萄糖的初始浓度为100 g/L时，补加葡萄糖次数、补加时间对发酵产2-KGA的影响。采用以下3种补料方式进行发酵，补料分批发酵结果见图1。

一次定量补料：当葡萄糖浓度降为15～25 g/L时，一次性补加含4 005 g葡萄糖补料液。

图1 不同葡萄糖补料方式对2-KGA发酵的影响Fig.1 Effect of different glucose feeding modes on the production of 2-KGA

三次定量补料：当葡萄糖浓度降为15～25 g/L时，分3次相等的量进行补加（1 335 g/次），使发酵过程中补加总糖质量为4 005 g。

五次定量补料：当葡萄糖浓度降为15～25 g/L时，分五次相等的量进行补加（801 g/次），使发酵过程中补加总糖质量为4 005 g。

通过比较2-KGA的产量、产率和生产强度发现分五次相等量的补加葡萄糖策略的效果最好（图1）。此时，2-KGA的产量、产率和生产强度分别达到245.7 g/L、0.96 g/g和5.12 g/L/h。出现这种情况的原因是通过补料降低了底物浓度、发酵液黏度，从而降低了底物抑制作用，并促进细胞对环境氧和营养物质的利用，提高了葡萄糖向2-KGA的转化速率提高了2-KGA的生产强度[9]。

2.2 硫酸铵补料方式对发酵的影响

在微生物发酵时，氮源是维持菌体自身生长必要的生长因子，其量的维持是保证菌体生长和转化的必要条件[10]，故考虑在发酵过程中根据菌体生长速率的变化加入适量的硫酸铵补充一定的氮源，保持菌体的正常生长和转化。

在最优葡萄糖补料方式、维持种子和发酵条件以及补料液相同条件下，在发酵培养基的初始硫酸铵浓度为5 g/L时，采用以下3种补硫酸铵方式进行发酵生产。

一次定量补料：在发酵16 h，一次性补加含240 g硫酸铵补料液。

间歇定量补料：在发酵16 h补加含64 g硫酸铵补料液，22 h补加含80 g硫酸铵补料液，28 h补加含96 g硫酸铵补料液。

间歇恒速补料：在发酵16 h，就以1.25 g/L/h的速度流加硫酸铵补料液，直至含240 g硫酸铵补料液全部补完。

从图2表明，硫酸铵的分次添加可以使发酵液中硫酸铵质量浓度维持在一个稳定的水平，既利于菌体的生长又利于葡萄糖向2-KGA的转化。通过比较发现间歇定量补料方式效果最好，2-KGA的产量、糖酸转化率和生产强度分别达到251.3 g/L，1.01 g/g和5.23 g/L/h。选择间歇定量补硫酸铵方式。

图2 硫酸铵补料方式对2-KGA发酵的影响Fig.2 Effect of（NH4）2SO4feeding modes on the production of 2-KGA

2.3 不同溶氧水平对发酵的影响

对于好氧发酵生产代谢产物来说，溶氧（Dissolved oxygen，DO）值的控制直接关系着细胞的生长和代谢产物的形成[11-12]。

在研究了葡萄糖和硫酸铵补料策略之后，考察了在最优补料策略下，不同DO浓度对2-KGA合成的影响。

由图3知，当DO值分别为20%、30%和40%时，随着其值的提升，细胞生物量逐渐增加，40%时达最大为8.11 g/L；当DO值50%时，细胞生物量反而减少。再综合2-KGA的产量、得率和产率指标，溶氧为40%时最优，其值分别达到268.5 g/L、1.04 g/g和 6.10 g/L/h。

综上可知，发酵生产2-KGA是需氧型，DO值的控制要适宜，不是越高越好。可能因为，氧的过高容易产生含氧自由基破坏细胞组分，从而严重影响菌体的生长代谢[13]。

图3 溶氧水平对2-KGA发酵的影响Fig.3 Effect of dissolved oxygen levels on the production of 2-KGA

2.4 30 L发酵罐上FMME043发酵生产2-KGA

在最优葡萄糖和硫酸铵补加策略下维持溶氧为40%，菌株FMME043发酵生产2-KGA的过程曲线表明，2-KGA发酵生产属于部分生长偶联型。如图4所示，1）菌体生物量：0～4 h为菌体的适应阶段为延滞期，之后菌体快速生长为对数生长期，32 h菌体生长减慢为稳定期，在36 h菌体干重达到最大值为8.41 g/L。2）底物葡萄糖：前期0～12 h葡萄糖的量下降很少，12 h之后葡萄糖的量迅速降低，28 h耗糖速率减慢，至发酵结束糖耗尽。3）产物2-KGA：0～12 h产物生成较少，12 h之后进入快速生成产物时期，28 h后产物的生成速度减慢，至发酵结束44 h，2-KGA产量为268.5 g/L，糖酸转化率为1.04 g/g。与在30 L发酵罐上优化前[2]相比，2-KGA的产量、产率和生产强度分别提高了58.4%，11.6%和72.8%。与其他生产2-酮基-D-葡萄糖酸菌株相比，FMME043产量和转化率最高，对今后的扩大化生产也具有重要的指导意义（见表1）。

图4 30 L发酵罐上Serratia sp.FMME043发酵产2-KGA的过程曲线Fig.4 Time curves of 2-KGA fermentation by Serratia sp.FMME043 in a 30 L fermentor

表1 高产2-KGA菌株及其产量Table 1 Strains for high 2-KGA production

3 结 语

1）在30 L发酵罐上优化确定了发酵生产2-KGA的最优补加策略及溶氧条件：当初糖浓度由100 g/L降至15～25 g/L，采用五次定量补料方式，使整个发酵过程中葡萄糖浓度低于7%；硫酸铵采用间歇定量补料，16 h补加64 g，22 h补加80 g，28 h补加96 g；溶氧控制在40%。

2）在最优条件下，菌体生长延滞期为4 h，36 h菌体干重达到最大值为8.41 g/L，发酵44 h时，2-KGA产量达到268.5 g/L，产率达到1.04 g/g。

3）通过对溶氧、葡萄糖和硫酸铵等发酵条件和培养基进行优化控制，提升了发酵效价，为今后的2-KGA工业化生产奠定了基础。