基于DNA增强荧光法快速测定养殖用水中孔雀石绿

丁洪流， 沈福苗， 成玉梁， 谢云飞， 于 航， 姚卫蓉， 郭亚辉*， 钱 和

(1.苏州市质量技术监督综合检验监测中心，江苏苏州 215000; 2.江南大学食品学院，江苏无锡 214000)

孔雀石绿(Nalachite Green,MG)是一种三苯甲烷类染料，在水产养殖中曾被广泛用作杀菌剂，但其具有毒性和致癌性，且毒性随着暴露时间、温度和浓度而增加[1 - 3]。但由于MG抗菌效果好、价格低廉，在水产养殖中仍有违规使用的情况。因此，出于对人们健康的考虑，以及对水产品质量的监督，建立一个快速测定水体中MG的分析方法具有重要的现实意义。

国内目前比较常见的MG检测方法有拉曼光谱法[4 - 5]、液相色谱法[6]、液相色谱-质谱联用法[8 - 9]、其他光谱法[10 - 11]和电化学分析法[12 - 13]等。这些方法相对来说均具有较好灵敏度和较低的检出限，但是也存在一些缺陷，比如拉曼光谱法纳米粒子不稳定，测定时受影响较大；液相色谱法前处理复杂，花费时间长，检测成本高；电化学方法则存在电化学修饰困难，操作难度大的问题。本文建立的DNA增强荧光法检测时间短，只需1.5～2.5 h即可完成检测，且操作简单，可应用于养殖水体快速检测。MG本身荧光强度小，不能直接使用荧光光谱仪进行检测。已有报道[14]表明MG可结合到富含G碱基DNA形成的G -四联体上，并且荧光强度显著增强，故本工作在此原理基础上，研究并建立了基于G -四联体增强的荧光法快速检测MG的新方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

F-4600荧光光谱仪(日本，Hitachi Co.Ltd)；M5酶标仪(美国，Molecular Devices公司)。

本研究使用的DNA均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。DNA的储备溶液用超纯水制备，并根据波长260 nm处的紫外吸光度准确定量浓度。孔雀石绿(MG)标准品(纯度96%)，购自北京百灵威科技有限公司。NaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液(PBS,0.2 mol/L，pH=6.6)：称取1.064 g Na2HPO4，1.950 g NaH2PO4·2H2O，溶解定容至100 mL。Tris-HCl缓冲溶液(0.05 mol/L，pH=6.5，100 mmol/L K+)：称取0.606 g Tris，0.745 g KCl，定容至100 mL，调节pH至6.5。Tris-HCl缓冲溶液(0.05 mol/L，pH=6.5，100 mmol/L Na+)：称取0.606 g Tris，0.584 g NaCl，定容至100 mL，调节pH至6.5。上述所用试剂均为分析纯。实验用水为 Milli-Q超纯水(18.2 MΩ·cm)。

水样取自江南大学校内小蠡湖。

1.2 检测体系筛选

DNA增强荧光法快速检测MG过程如下：在170 μL缓冲溶液中，依次加入10 μL 100 μmol/L DNA，20 μL 100 μmol/L MG溶液(线性实验中为20 μL不同浓度的MG标准溶液，实际样品检测时为20 μL水样)，使检测体系总体积为200 μL，剧烈混匀后，室温静置1 h，在630 nm激发波长下进行荧光测定，激发和发射狭缝均设定为20 nm。分别改变缓冲溶液和DNA种类进行上述检测过程。荧光测定使用酶标仪(M5，美国Molecular Devices公司)。

1.3 检测限及实际样品测定

改变检测体系中MG浓度并进行荧光检测，并制作标准曲线，采用3倍噪声值时的浓度作为检测限。采用本研究检测方法直接检测。回收率测定：将取至小蠡湖的水样作为基质，向其中加入MG标准溶液，使其浓度分别为0.5、1.0、5.0 μmol/L，配制成模拟水样进行检测。具体检测过程同上。

1.4 荧光强度及稳定性实验

采用0.5、1.0、5.0 μmol/L 3个浓度的MG溶液，分别改变DNA浓度，采用上述体系进行实验。测定荧光强度。稳定性实验：H22 DNA(5 μmol/L),Tris-HCl缓冲溶液(0.05 mol/L，pH=6.5，100 mmol/L K+)与1 μmol/L MG形成的检测体系产生的荧光强度，通过放置不同时间检测其荧光强度。

2 结果与讨论

2.1 最佳检测条件的选择

表1罗列了本实验中采用的11种DNA序列，均为富G序列。3种缓冲溶液分别为磷酸盐缓冲溶液(PBS)、含100 mmol/L K+Tris-HCl缓冲溶液和含100 mmol/L Na+Tris-HCl缓冲溶液。

表1 11种寡核苷酸(DNA)名称及序列

图1 分别由3种缓冲溶液及11种DNA序列组成的33种检测体系测定孔雀石绿的相对荧光强度Fig.1 Relative fluorescence intensity of malachite green in 33 detection systems consisting of 3 kinds of buffer solutions and 11 kinds of DNA sequences

分别改变检测体系中缓冲溶液种类以及DNA种类进行DNA增强荧光法快速检测，研究不同体系对MG荧光增强的影响。图1所示为3种缓冲溶液及11种DNA序列检测体系测定MG相对荧光强度结果三维柱状图。如图所示，共有33个体系，每个体系分别对应于一个空白对照，x轴上对应的列为11种DNA分别与3种缓冲溶液形成的体系，y轴上对应的行为3种缓冲溶液分别与11种DNA形成的溶液，包括三行对照。首先，分别从3种溶液进行观察。在PBS体系中，与DNA8形成的体系与MG结合显示最强的荧光，其次是DNA7和DNA6，三者区别不大，最小的是DNA9。在含100 mmol/L Na+Tris-HCl缓冲溶液中，与DNA8形成的体系与MG结合具有最大的荧光强度，其次是DNA7和DNA6，三者区别不大，最小的是DNA9，这个结果与PBS体系类似。在含100 mmol/L K+Tris-HCl缓冲溶液中，与DNA11形成的缓冲体系测定MG具有最强荧光，其次是DNA5，最小的是DNA9。其次，纵观11种DNA，DNA1、2、3、4、9、10与3种溶液形成的体系测定MG荧光强度具有一致性，说明这些DNA与MG作用产生荧光强度几乎不受这3种缓冲溶液种类的影响。DNA6、7、8与含100 mmol/L K+Tris-HCl缓冲溶液形成的体系检测荧光强度小于其它两种溶液。DNA5和DNA11与含100 mmol/L K+Tris-HCl缓冲溶液形成的体系检测荧光强度大于其它两种溶液。从整体上来看，DNA11与含100 mmol/L K+Tris-HCl缓冲溶液形成的体系检测MG具有最大的相对荧光强度。PBS和含100 mmol/L Na+Tris-HCl缓冲溶液与含100 mmol/L K+Tris-HCl缓冲溶液形成的体系具有显著性差异，结合3种缓冲溶液的组成进行对比分析，可以推测影响DNA与MG结合产生的荧光强度的主要因素是盐离子，且Na+和K+对不同种类的DNA的影响结果是不同的。

图2 MG与DNA11-Tris-HCl(100 mmol/ K+)缓冲溶液体系检测MG的荧光光谱图对比Fig.2 Comparison of fluorescence spectra of MG and MG detected by DNA11-Tris-HCl(100 mmol/K+) buffer solution system

从上述筛选实验结果可得DNA11与含100 mmol/L K+Tris-HCl缓冲溶液形成的体系结合MG产生的荧光相对强度最大，故采用此检测条件进行后续检测实验。图2所示为MG自身荧光光谱图与DNA11-Tris-HCl(100 mmol/L K+)缓冲体系检测10 μmol/L MG的荧光光谱图。可以观察到添加了DNA缓冲体系后的MG溶液荧光强度显著性增强(增强了约36倍)，这是由于H22 DNA在Tris-HCl(100 mmol/L K+)缓冲体系中易稳定形成分子内G -四联体结构[15]。文献的报道[16]中也指出体外生物浓度(20 mmol/L)下的K+、Na+离子可以稳定DNA形成的G-四联体结构，以前者的效果明显[16]。对检测溶液进行激发和发射光谱扫描发现最大激发/发射波长为630/680 nm，其结果与MG自身最大激发和发射波长相近。

2.2 DNA浓度选择及荧光稳定性研究

对筛选出的DNA11-Tris-HCl体系进行DNA浓度研究，选择了3个浓度(0.5、1.0、5.0 μmol/L)MG，用不同浓度的DNA分别进行检测。结果如图3所示，可以观察得到3个浓度MG检测结果具有相似性，随着DNA浓度的增加，检测体系荧光强度增大，DNA浓度在3.0 μmol/L之前时，荧光强度增大非常迅速，在5.0 μmol/L时基本达到稳定。猜测DNA浓度增大荧光强度随之增大的原因是随着DNA浓度增大，DNA与MG比率也增大，溶液中DNA分子数增加，故而形成的G -四联体结构数量也增加，故而MG分子能更容易的，也更多的结合至G -四联体上，从而荧光强度增大。结合实验结果综合考虑，DNA浓度选择5.0 μmol/L。

图3 DNA浓度优化Fig.3 Optimization of DNA concentrations

采用DNA11-Tris-HCl-MG体系，DNA浓度5.0 μmol/L，MG浓度1.0 μmol/L，分别放置不同的时间测定荧光强度。结果显示荧光强度在1 h之内快速达到最大值，在30 h之内基本保持恒定。

图4 DNA增强荧光法检测MG标准曲线Fig.4 Standard curve of DNA-enhanced MG fluorescence assay

2.3 标准曲线及检测限

对于H22 DNA增强MG的荧光强度与MG浓度的相关性进行了研究。配制0～6 μmol/L系列标准溶液进行荧光强度测定，结果如图4所示。测定MG荧光强度与其浓度有很好的线性相关性，线性方程为：y=5206.902x+277.866，相关性系数(R2)达0.9941，线性范围为0.1～6.0 μmol/L。根据标准曲线，以3倍噪声值时的浓度作为检测限，得到此方法的检测限为0.083 μmol/L。

2.4 选择性实验

选择水产养殖常用的7种抗生素作为对照，分别为甲砜霉素、盐酸四环素、罗红霉素、氟苯尼考、氯霉素琥珀酸钠、氯霉素、头孢拉定。结果如图5(A)所示，激发波长为630 nm，检测结果差异非常显著，可知此方法检测MG具有非常好的选择性。图5(B)所示为干扰性实验，分别在MG标准溶液中添加等量的7种抗生素，结果显示，MG分别添加7种抗生素后检测的相对荧光强度与未添加的MG检测结果相近，其荧光强度并未出现显著性变化，故此方法用于检测养殖水体中的孔雀石绿具有很好的实用性。

图5 (A)7种抗生素及MG检测的相对荧光强度;(B)MG及分别添加7种抗生素的MG的相对荧光强度Fig.5 (A)Relative fluorescence intensities of 7 kinds of antibiotics and MG;(B)Relative fluorescence intensities of MG and MG with 7 kinds of antibiotics added

2.5 实际样品检测及回收率测定

实际样品用DNA增强荧光快速检测法进行检测,结果未检出。为测试该方法在实际样品中的检测能力，进行了加标回收率实验。将取至小蠡湖的水样作为基质，向其中加入MG标准溶液，使其浓度分别为0.5、1.0、5.0 μmol/L，配制成模拟水样进行检测，如表2所示，回收率范围为93.4%～119.3%。该方法有望应用于实际样品的检测中。

表2 实际样品检测回收率表

3 结论

本文利用分子内G -四联体DNA与孔雀石绿结合会显著性增强孔雀石绿荧光强度的原理，建立了一种快速、简便、高效的养殖水体中MG的快速检测方法。该方法基本无需前处理，且操作过程简单快捷，检测周期非常短，稳定性好，抗干扰性强，可应用于养殖水体MG快速检测，对筛查MG具有现实意义。