膀胱癌O⁶_-甲基鸟嘌呤-DNA转移酶基因启动子甲基化及其临床意义

刘晓丽 单晓辉 王桃霞 冯淑宁 王晓英 段小婷 李桂英

[摘要] 目的 研究膀胱癌O6-甲基鸟嘌呤-DNA转移酶（MGMT）基因启动子甲基化情况，探讨其与临床病理特征间的关系及临床意义。 方法 选取2010年1月～2012年1月于河北工程大学附属医院就诊并行手术切除治疗的膀胱癌患者93例，选取同期就診且经膀胱镜检查证实无膀胱肿瘤的47例患者作为对照。应用甲基化特异聚合酶链式反应（PCR）检测膀胱癌组织和正常膀胱黏膜组织中MGMT基因甲基化状况。统计分析MGMT甲基化与临床病理特点关系，Kaplan-Meier分析MGMT甲基化与患者预后间的关系。 结果 膀胱癌组织中MGMT相对甲基化程度明显高于正常膀胱组织，差异有统计学意义（P < 0.01）。MGMT甲基化与分期、分级相关（均P < 0.01），与年龄、性别、肿瘤大小、数目、形态及复发频率无关（均P > 0.05）。Kaplan-Meier生存分析发现甲基化组患者5年总体生存率明显低于非甲基化组（均P > 0.05）。 结论 膀胱癌组织中MGMT基因甲基化水平明显增高，MGMT甲基化与肿瘤分期、分级及不良预后有关，可作为判断膀胱癌病情判断及预后的分子生物学标志，值得临床关注。

[关键词] 膀胱癌;O6-甲基鸟嘌呤-DNA转移酶;甲基化;临床意义

[中图分类号] R737.14          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）03（b）-0022-04

膀胱癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤，发病率在我国泌尿系肿瘤中排在第一位，死亡率较高[1]。病理类型包括移行细胞癌、鳞状细胞癌、腺癌、小细胞癌等。膀胱癌的发病机制与癌基因激活及抑癌基因的失活有关[2]，导致细胞正常生长和死亡调控机制异常，细胞无限增殖。近年来膀胱癌的发病机制研究虽有很大进展，但目前仍无法有效预测和阻止肿瘤复发、进展和转移的发生，因此需对膀胱癌发病机制进一步研究。寻找肿瘤发生发展的分子生物学标志物及有效药物治疗靶点是近年来的研究热点[3]，O6-甲基鸟嘌呤-DNA转移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT），是一种高效的DNA修复酶，可以修复DNA中损伤的6氧甲基鸟嘌呤。MGMT基因是一种抑癌基因，研究[4]表明MGMT基因启动子区富含CpG区甲基化是该抑癌基因失活的机制之一，并与膀胱癌的恶性生物学行为相关，其有希望成为判断膀胱癌预后的分子生物学标志物。本研究对膀胱癌组织中MGMT基因启动子区甲基化进行分析，并探讨其与临床病理特征及预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2010年1月～2012年1月于河北工程大学附属医院（以下简称“我院”）就诊并行手术切除治疗的膀胱癌患者93例。纳入标准：①初次发现膀胱癌，术后组织病理学检查明确诊断为膀胱细胞癌。②未接受手术、放化疗等肿瘤治疗。③所有患者或其家属对本研究均已知情同意，且签署知情同意书。④病历资料齐全，均完成随访。排除标准：①合并免疫系统疾病者。②合并全身严重感染等严重疾病者。③合并其他恶性肿瘤。在入选的93例患者中男70例，女23例;年龄29～82岁，平均（39.63±9.70）岁;年龄≤60岁40例，>60岁53例;病理分级：其中高分化33例，中低分化60例;分期标准参照国际抗癌联盟2009年TNM分期系统[5]：肌层浸润69例，非肌层浸润24例;肿瘤单发43例，多发50例;肿瘤直径≤3 cm者68例，直径>3 cm者25例;乳头状肿瘤70例，非乳头状肿瘤23例;术后定期查尿脱落细胞、膀胱镜检查判断有无肿瘤复发，其中无复发60例，有复发33例。所有患者术后随访1～60个月，平均（47.6±8.7）个月，以门诊或电子通讯方式，随访至死亡或随访时间结束（截至2017年1月）。对照人群选取同期就诊并接受外科手术治疗，且经膀胱镜证实无膀胱肿瘤的患者，良性前列腺增生患者32例，膀胱结石15例，共47例，其中男17例，女30例;年龄30～82岁，平均（38.89±9.81）岁;年龄≤60岁23例，>60岁24例。本研究经我院医学伦理委员会审核批准。

1.2 MGMT甲基化表达检测

提取与纯化石蜡包埋组织DNA，依据QIA mp Mini Kit试剂盒（美国Qiagen公司，27104）说明书进行，然后应用亚硫酸氢钠修饰基因组DNA，操作按照EZ DNA Methylation-Gold Kit说明书（美国ZYMO RESEARCH公司，D5005）进行，以将DNA中尚未甲基化的胞嘧啶（C）修饰为尿嘧啶（U）。甲基化特异PCR：引物由北京奥科生物技术有限公司合成，MGMT基因甲基化引物正义链序列：5′-TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC-3′，反义链序列：5′-GCACTCTCCGA-AAACGAAACG-3′，MGMT基因非甲基化引物正义链序列：5′-TTTGTGTTTTGATGTTTGTAGGTTTTTGT-3′，反义链序列：5′-AACTCCACACTCTTCCAAAAACAA-AACA -3′。反应体系根据PCR反应试剂盒说明（美国Fermentas公司）进行，反应程序为：95℃预变性5 min;然后进行35个循环的扩增反应，程序为95℃变性30 s，60℃退火60 s，72℃延伸30 s;72℃延伸10 min，4℃保温。反应结束后取10 μL反应产物，应用2%琼脂糖凝胶进行电泳，以去离子水为阴性对照，应用成像分析系统照相。根据DNA条带判断结果：①判断甲基化阳性：M引物扩增出目的条带，而U引物未扩增出或未扩增出目的条带。②判断甲基化阴性：U引物扩增出目的条带，M引物未扩增出目的条带。用图像分析系统计算出各条带密度值，计算同一标本的甲基化条带/非甲基化条带密度值，得出标本的相对甲基化程度。

1.3 统计学方法

采用SPSS 16.0统计学软件对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验，计数资料采用百分率表示，组间比较采用χ2检验;Kaplan-Meier生存分析（Log-rank检验）评价MGMT基因甲基化对生存率影响。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MGMT甲基化情况及比较

47例正常膀胱黏膜组织MGMT均未发现甲基化，样本仅见非甲基化条带;93例膀胱细胞癌组织中60例出现甲基化，可见甲基化与非甲基化两条条带或甲基化一条条带，33例仅见非甲基化条带。膀胱细胞癌组织MGMT相对甲基化程度明显高于正常膀胱黏膜组织，差异有统计学意义（P < 0.01）。

2.2 膀胱癌组织MGMT甲基化与临床病理特点关系

MGMT基因启动子区甲基化与年龄、性别、肿瘤大小、数目、形态及复发无关（均P > 0.05），与肿瘤分期、分级有关，差异有统计学意义（均P < 0.01）。见表1。

2.3 Kaplan-Meier生存曲线分析MGMT甲基化对患者预后影响

93例膀胱癌患者随访至术后5年，Kaplan-Meier生存分析（Log-rank检验）发现，MGMT未甲基化患者的5年总生存率显著高于MGMT甲基化患者5年总生存率，差异有统计学意义（？字2=7.351，P = 0.004）。

3 讨论

目前膀胱癌的主要治疗方式包括手术、化疗等，但不能达到治愈目的，对术后出现肿瘤进展和转移的患者预后较差。膀胱癌复发和进展的危险因素包括肿瘤分期、分级、大小、复发频率等，但均无法准确预测肿瘤的生物学行为及评估预后。因而人们希望寻找新的分子生物标志。研究[6-8]发现，多种人类肿瘤组织，如膀胱癌、肺癌、胶质瘤、结直肠癌等，均存在MGMT启动子异常甲基化现象，其与肿瘤发生、增殖、浸润和转移等过程密切相关。Jahed等[9]在非肌层浸润膀胱癌研究中发现，45%癌组织MGMT发生甲基化，复发的癌组织MGMT甲基化高达92.5%，MGMT甲基化与肿瘤复发和转移密切相关。Bilgrami等[10]研究发现MGMT甲基化与低分化肌层浸润膀胱癌关系密切，可作为评价膀胱癌侵袭性的标志。此外，DNA甲基化修饰多发生于肿瘤的早期阶段，血液、尿液和唾液等标本中分子標志水平异常可用于肿瘤早期诊断，减少不必要的膀胱镜检查及活检[11]。国外学者[10]在膀胱癌患者血清标本中发现MGMT甲基化，且认为其与癌组织中MGMT甲基化水平密切相关。亦有学者[12]观察到膀胱癌患者尿液标本中MGMT甲基化水平升高。这些研究有助于膀胱癌早期无创检测。

MGMT是一种抑癌基因，定位于人类染色体10q26，其编码的MGMT蛋白包含207个氨基酸长度，是一种DNA修复酶。MGMT基因表达受启动子区CpG岛的特殊位点调控，启动子区异常甲基化使其活力部位与底物甲基结合后丧失活性，导致抑癌基因转录失活。国外学者[13]报道显示，非肌层浸润膀胱癌和肌层浸润膀胱癌均存在MGMT基因异常高甲基化，且在高级别、肌层浸润膀胱癌中更为常见。非肌层浸润膀胱癌MGMT启动子的异常高甲基化与肿瘤复发、进展和较短的整体生存时间有关[14-16]。本研究发现，93例膀胱细胞癌组织中，60例出现MGMT甲基化，MGMT甲基化与膀胱癌分期、分级相关，且多见于中低分化、肌层浸润肿瘤组织中，提示MGMT甲基化在膀胱癌发生发展中起重要作用，MGMT甲基化可作为膀胱癌恶性行为的生物标志。其作用机制可能是膀胱癌组织中MGMT基因启动子通过发生甲基化，导致表达沉默，从而使其对肿瘤细胞凋亡的调控作用受到抑制[17-18]。本研究对93例膀胱癌患者术后5年随访中发现，MGMT甲基化组患者的总体生存率明显低于未甲基化组患者，提示MGMT甲基化提示膀胱癌患者不良预后，与文献[19-20]报道一致可能与发生MGMT甲基化的膀胱癌多为中低分化、肌层浸润肿瘤有关。

综上所述，MGMT基因启动子区甲基化参与膀胱癌的发生、发展，MGMT甲基化可作为预测膀胱癌不良预后的分子标志，MGMT甲基化检测可能成为膀胱癌诊断和预后的重要手段，有助于新的膀胱癌预后的评估体系的建立以及作为抗肿瘤药物研发的治疗靶点。

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（收稿日期：2018-10-10  本文編辑：封   华）