R-Spondin2、Syndecan-1 在小鼠肝星状细胞活化中的作用研究

殷新光 徐龙生 吴一鸣 薛文英 徐英

肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSC）是肝脏合成细胞外基质的主要细胞，其活化可诱导细胞外基质合成与降解的失衡，导致肝纤维化的发生[1]。在慢性肝损伤中HSC要经历增殖与表型的转变，由原来富含维生素A类物质的静止的表型“转分化”为活化的肌纤维母细胞样表型，即HSC发生活化[2]。在此过程中，多种信号通路参与，如 Wnt/p-catenin、Jagged/Notch 信号通路[3]。R-脊椎蛋白 2（roof plate-specific spondin-2，R-Spondin2）、多配体蛋白聚糖1（Syndecan-1）均是Wnt/p-catenin信号通路重要的调节分子[4-5]。基于此，本研究采用体外实验研究的方法，探讨R-pondin2、Syndecan-1在HSC活化中的作用及可能的作用机制，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 主要材料、试剂和仪器 24只8～10周龄健康雄性昆明种小鼠（江苏齐氏实验动物中心），体重38～40g。兔多克隆α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体（美国R&D公司）；小鼠R-Spondin2抗体、小鼠Syndecan-1抗体、小鼠重组R-Spondin2蛋白、小鼠重组Syndecan-1蛋白（美国Sigma公司）；第二抗体（武汉博士德生物科技有限公司）；DMEM、Trizol和 FBS（美国 Invitrogen公司）；RIPA裂解液、逆转录试剂盒、链霉蛋白酶E、Ⅳ型胶原酶、SYBR试剂、BSA、DAPI（武汉博士德生物科技有限公司）；离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司）、紫外分光光度计（上海仪电分析仪器厂）、电泳仪（美国Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 实验小鼠分组与HSC分离制备 将小鼠按随机数字表法分为6组，每组4只，均在实验室标准条件下饲养，自由摄取食物和水，适应性喂养1周。采用颈椎脱臼法处死小鼠，解剖出小鼠肝脏，用链霉蛋白酶E和Ⅳ型胶原酶灌流小鼠肝脏，Nycodenz密度梯度离心分离并培养原代小鼠HSC。细胞计数法测细胞得率，锥虫蓝拒染法测细胞存活率（确保存活率＞90%）。H1组：HSC分离培养 1d；H2组：HSC 分离培养 3d；H3组：HSC 分离培养7d；R+S-组：HSC分离培养24h后，给予20 ng/ml R-Spondin 2刺激24h；R-S+组：HSC分离培养24h后，给予 20 ng/ml Syndecan-1刺激 24h；R-S-组：HSC分离培养48h，未予任何刺激。分离的HSC以1×105个/cm2接种于含体积分数10%FBS的DMEM培养基中，在37℃、5%CO2条件下培养[6]。收集各组HSC进行后续实验。

1.2.2 外源性R-Spondin2、Syndecan-1刺激 R+S-组、RS+组、R-S-组小鼠分离的 HSC HSC 以 1×105个/ml接种于96孔培养板，待细胞贴壁后，换无血清培养基培养24 h。对R+S-组HSC给予20 ng/ml重组R-Spondin2蛋白刺激24 h；对R-S+组HSC给予20 ng/ml重组Syndecan-1蛋白刺激24 h；R-S-组HSC仅分离培养48h。收集R+S-组、R-S+组、R-S-培养的HSC进行后续实验。

1.2.3 各组小鼠 HSC R-Spondin2、Syndecan-1、α-SMA蛋白表达水平检测 采用Western blot法。RIPA裂解液提取各组HSC总蛋白，用紫外分光光度计测定蛋白质浓度。聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、转膜、5%脱脂奶粉封闭后，分别加入 R-Spondin2 抗体（1∶1 500）、Syndecan-1抗体（1∶1 000）和 α-SMA 抗体（1∶500），4℃孵育过夜。洗膜后加入第二抗体（1∶2 000），室温孵育2h后采用电化学发光试剂检测。以GAPDH为内参照，凝胶扫描成像系统（美国Bio-Rad公司）对各条带的灰度值进行分析，检测目的蛋白的相对表达水平。

1.2.4 H1、H2、H3组小鼠 HSC R-Spondin2、Syndecan-1、α-SMA mRNA表达水平检测 采用RT-PCR法。PCR引物由上海齐合生物工程技术有限公司合成，见表1。Trizol法提取HSC总RNA，-80°C保存。紫外分光光度计测定260 nm和280 nm波长处的吸光度值，计算提取的总RNA浓度。用逆转录试剂盒逆转录合成cDNA，-20℃保存。PCR 体系：SYBR 试剂 10μl，浓度 10μmol/L的上、下游引物各 0.5μl，样品 cDNA 2μl，双蒸水 7μl。PCR 条件：95℃ 4min；95℃ 30s，60℃ 45s，72℃ 1 min，共35个循环；72°C延伸5 min。用SDS软件进行数据分析，用比较Ct值（循环阈值）的方法分析结果，目的mRNA的相对表达水平由GAPDH进行标准化。

1.2.5 H1、H2、H3组小鼠HSC活化状态观察 采用免疫荧光染色法。待H1组、H2组、H3组细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1%Triton X-100透膜15min；PBS再次冲洗，然后在室温条件下用4%BSA封闭细胞30min；按1∶150的比例稀释α-SMA、Desmin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育过夜；PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1∶100的比例稀释二抗，37℃条件下放置1h；用PBS冲洗3次，每次10min，最后DAPI染细胞核并用显微镜拍照观察HSC活化状态。

1.3 观察指标 （1）观察H1、H3组小鼠HSC活化状态；（2）比较 H1、H2、H3组小鼠 HSC α-SMA 蛋白与 mRNA表达水平；（3）比较 H1、H2、H3组小鼠 HSC R-Spondin2和Syndecan-1蛋白与mRNA表达水平；（4）比较R+S-组、R-S+组、R-S-组小鼠 HSC R-Spondin2、Syndecan-1、α-SMA蛋白表达水平。

1.4 统计学处理 应用SPSS 15.0统计软件；计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，两组比较采用两独立样本t检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 PCR引物

2 结果

2.1 H1、H3组小鼠HSC活化状态观察结果 见图1（插页）。

由图1可见，免疫荧光染色结果显示H1组小鼠HSC α-SMA蛋白表达微弱，处于未活化状态；H3组小鼠HSC，即HSC分离培养7d，α-SMA蛋白高度表达，具有肌细胞特征，有向肌成纤维细胞转化趋势，这说明HSC在体外培养时发生了从静息到活化状态的转变。

2.2 H1、H2、H3组小鼠 HSC α-SMA 蛋白与 mRNA 表达水平比较 见表2。

表2 H1、H2、H3组小鼠HSCα-SMA蛋白与mRNA表达水平比较

由表 2 可见，H1、H2、H3组小鼠 HSC α-SMA 蛋白与mRNA表达水平比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），且组间两两比较差异亦均有统计学意义（均P＜0.05），H3组小鼠HSC α-SMA蛋白与mRNA表达水平＞H2组＞H1组。即随着HSC的活化，α-SMA蛋白与mRNA的表达水平上调且呈时间依赖性地上升。

2.3 H1、H2、H3组小鼠 HSC R-Spondin2 和 Syndecan-1蛋白与mRNA表达水平比较 见表3。

表 3 H1、H2、H3组 HSC R-Spondin2 和 Syndecan-1 蛋白与 mRNA表达水平比较

由表 3 可见，H1、H2、H3组小鼠 HSC R-Spondin2 和Syndecan-1蛋白与mRNA表达水平比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），且组间两两比较差异亦均有统计学意义（均P＜0.05），H3组小鼠HSC R-Spondin2蛋白与mRNA表达水平＞H2组＞H1组，而H3组小鼠Syndecan-1蛋白与mRNA表达水平＜H2组＜H1组。即随着HSC的活化，R-Spondin2的表达上调并呈时间依赖性地上升，Syndecan-1表达下调且呈时间依赖性地下降。

2.4 R+S-组、R-S+组、R-S-组小鼠 HSC R-Spondin2、Syndecan-1、α-SMA蛋白表达水平比较 见表4。

表 4 R+S-组、R-S+组、R-S-组小鼠 HSC R-Spondin2、Syndecan-1、α-SMA蛋白表达水平比较

由表4可见，R-S+组小鼠HSC R-Spondin2蛋白表达水平低于 R-S-组小鼠 HSC（P＜0.05）。R+S-组、R-S-组小鼠HSC Syndecan-1蛋白表达水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。R+S-组、R-S+组、R-S-组小鼠 HSC α-SMA蛋白表达水平比较差异有统计学意义（P＜0.05），组间两两比较差异亦均有统计学意义（均P＜0.05），R+S-组小鼠 HSC α-SMA 蛋白表达水平＞R-S-组＞R-S+组。即Syndecan-1负向调控R-Spondin2的表达，介导HSC的活化。

3 讨论

肝纤维化是由不同病因引起的慢性肝病发生、发展的必经过程，对肝纤维化的预防和早期干预是稳定病情、防止肝纤维化向肝硬化、肝癌发展的有效措施[7]。因此，深入研究肝纤维化的发生、发展机制，对慢性肝病的防治具有重要意义。HSC是肝脏合成细胞外基质的主要细胞，其活化即发生肌成纤维细胞的表型转换是肝纤维化发生的中心环节[8]。本研究以分离培养的小鼠HSC为研究对象，运用Western blot、RT-PCR、免疫荧光等检测方法探讨HSC活化过程中的相关机制，对阐明或阻断HSC的活化，防治肝纤维化的发生具有重要意义。

HSC的活化受众多细胞因子的调控，现有研究发现Wnt信号通路影响HSC的活化，阻断Wnt信号通路可抑制HSC的增殖、诱导其凋亡[3]。R-Spondin蛋白家族是Wnt信号通路的重要调控因子，包括4种成员：RSpondin1、2、3、4。其序列相似度为 40%～60%，且具有相似的结构模式[9]。R-Spondin家族蛋白在消化道的组织分化、器官形成及疾病发生过程中发挥重要作用，RSpondin1对小肠表皮细胞生长有重要影响，而且RSpondin1能诱导小肠干细胞，对放化疗有保护作用[10-11]。R-Spondin2-LGR5信号对结肠癌有抑制作用[12]。另有研究发现，由R-Spondin2介导的信号通路能够调控致命肠道腹泻的易感性[13]。上述研究表明在消化道发育和疾病发生过程中，R-Spondin对调控细胞的增殖、分化、迁移能力起着重要的作用。

本研究结果显示，随着体外培养HSC时间的延长，α-SMA的表达水平呈时间依赖性地上升，且免疫荧光染色显示HSC分离培养到第7天，α-SMA蛋白高度表达，具有肌细胞特征，向肌成纤维细胞转化趋势，HSC发生了从静息到活化的状态转变。在此过程中，RSpondin2的表达水平也随时间延长而明显上调。这提示R-Spondin2可能参与调控HSC的活化。

Sydecan-1属细胞表面跨膜蛋白多糖，是膜表面黏附受体，属于细胞间质、质膜的重要组成成分[14]。Sydecan-1以共价受体方式调节细胞与微环境之间的相互作用，参与组织器官发育、血管形成、组织再生等生理过程，它的表达受高度调节，具有细胞类型和发育阶段特异性[15]。细胞利用整合素和Sydecan-1双受体介导细胞-细胞外基质的黏附，促进细胞增殖，维持细胞分化类型，抑制肿瘤细胞生长[16]。本实验研究结果发现，随着体外培养HSC时间的延长，Sydecan-1蛋白与mRNA的表达呈时间依赖性地下降，Sydecan-1也可能参与调控HSC的活化。本研究结果还显示，在HSC的活化过程中，R-Spondin2表达上调，而Syndecan-1表达下调。两者是否存在于同一调控网络内，与HSC的活化是何种关系，尚未见文献报道。本研究对分离的小鼠HSC分别给予R-Spondin2、Syndecan-1重组蛋白刺激，结果显示，RSpondin2蛋白刺激24h，α-SMA蛋白表达上调，而Syndecan-1表达差异无统计学意义；给予重组Syndecan-1蛋白刺激24 h，R-Spondin2、α-SMA蛋白表达均发生下降。因而笔者推测，R-Spondin2和Syndecan-1共同参与HSC的活化，并且Syndecan-1负向调控R-Spondin2的表达，从而促使HSC发生活化。

综上所述，本研究结果显示体外分离培养小鼠HSC，可使其发生活化，在此过程中，Syndecan-1表达下调，负向调控R-Spondin2表达上调，从而诱导α-SMA表达增加促使HSC活化。这提示结合R-Spondin2、Syndecan-1两者相互研究，或将为阐明或阻断HSC的活化，防治肝纤维化的发生提供实验依据。