芪板青颗粒质量控制研究

林仙军，王彬，陈晓林，蔡文金

(浙江省兽药饲料监察所，杭州 311101)

芪板青颗粒由黄芪、板蓝根、金银花、蒲公英、大青叶和甘草通过水煎煮、过滤、浓缩、加辅料、干燥制得，具有清热解毒的功能，畜禽养殖中主要用于鸡传染性法氏囊病的辅助治疗。该产品的质量标准收载于《兽药质量标准(2017年版)》中药卷[1 ]中，标准仅采用薄层色谱法对绿原酸、咖啡酸和黄芪甲苷进行定性，未测定其含量。这三种成分为芪板青颗粒的主要活性成分之一[2]，含量的高低对药物的疗效有很大影响[3]。高效液相色谱法具有快捷、准确、灵敏度高的特点[4-5]。高效液相色谱-二极管阵列检测器法(HPLC-DAD)结合了光谱扫描和数据库功能[6-7]，定性定量更准确[8]；高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)为通用性检测器[9]，可直接检测无紫外吸收的物质[10-11]。目前，没有查询到芪板青颗粒含量测定的有关文献。因此，为了完善该产品的质量控制方法，研究并建立高效液相色谱法测定有效成分具有现实意义。

1 仪器与材料

1.1 仪器 高效液相色谱仪，Agilent 1260，配Agilent 1260 Infinity G4212A型二极管阵列检测器；高效液相色谱仪，Agilent 1260，配Agilent 1260 G4260B ELSD检测器；AG-285电子天平(Mettler公司)；DELTA320 pH计(Mettler公司)；KQ-500E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试剂与材料 甲醇和乙腈为色谱纯，磷酸、氨水、正丁醇、乙醇、乙酸乙酯、三氯甲烷、甲酸、乙酸丁酯、硫酸和丙酮均为分析纯;实验用水为milli-Q超纯水。咖啡酸为中国食品药品检定研究院产品，批号110885-201703，含量100.0%；绿原酸为中国兽医药品监察所产品，批号Z0261702，含量98.3%；黄芪甲苷为中国兽医药品监察所产品，批号Z0371312，含量94.4%。芪板青颗粒，为浙江金大康动物保健品有限公司产品，批号为20180822、20180823和20180824。

2 方法与结果

2.1 溶液配制

2.1.1 对照品储备液和对照品溶液配制 称取绿原酸对照品18.37 mg和咖啡酸对照品15.30 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，为绿原酸和咖啡酸对照品储备液；取5.00 mL，加50%甲醇溶液稀释并定容至50 mL,为绿原酸和咖啡酸对照品溶液。

称取黄芪甲苷对照品25.00 mg，置50 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解定容，摇匀，为黄芪甲苷对照品溶液。

2.1.2 绿原酸和咖啡酸供试品溶液配制 精密称取供试品约2 g，加乙醇30 mL，加热回流30 min，滤过，滤液蒸干，加甲醇溶解，并转移至25 mL量瓶中，定容，摇匀，为供试品溶液。

2.1.3 黄芪甲苷供试品溶液配制 取本品15 g，精密称定，加甲醇30 mL，超声30 min，滤过，再加甲醇30 mL重复提取2次，滤液合并，蒸干，残渣加水10 mL微热使溶解，转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇溶液提取3次，每次30 mL，合并正丁醇液，用3%氨试液洗涤2次，每次30 mL，弃去氨试液，收集正丁醇液，置蒸发皿中蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至5 mL量瓶中，定容，摇匀，过0.45 μm滤膜，滤液作为供试品溶液，为供试品溶液。

2.2 色谱条件

2.2.1 绿原酸和咖啡酸测定色谱条件及系统适用性试验 采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱(Agilent Eclipse XDB-C18 250 mm×4.6 mm 5 μm)，流动相为0.05%磷酸溶液-乙腈(92∶8，V∶V)；进样量10 μL，柱温30 ℃，流速为1.0 mL/min，在190 nm～400 nm范围进行扫描，记录327 nm色谱图。绿原酸和咖啡酸对照品溶液色谱图(图1)、绿原酸光谱图(图2)、咖啡酸光谱图(图3)和绿原酸和咖啡酸供试品溶液色谱图(图4)。绿原酸、咖啡酸和其他峰分离度符合要求。

2.2.2 黄芪甲苷测定色谱条件及系统适用性试验

采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱(Waters symmetry C18，5 μm, 4.6 mm×250 mm)，进样量10 μL，漂移管温度35 ℃，雾化器温度35℃，通气气流流速1.2 L/min，流动相为水-乙腈(65∶35,V∶V)，柱温30 ℃，流速1.0 mL/min。得到黄芪甲苷对照品色谱图(图5)和黄芪甲苷供试品溶液色谱图(图6)。

2.3 线性关系考察 精密量取绿原酸和咖啡酸对照品储备适量，制成相应浓度的系列标准品溶液，以浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线。绿原酸在3.611～72.23 μg/mL范围内线性良好, 线性回归方程为Y=30.54781X-3.22028，线性相关系数为0.99999;咖啡酸在3.060～61.20 μg/mL范围内线性良好,线性回归方程为Y=52.27768X-4.49668，线性相关系数为0.99999。

精密吸取黄芪甲苷对照品溶液10、20 μL，注入液相色谱仪，测定，以峰面积Y的对数值对浓度X的对数值作图, 得工作曲线。黄芪甲苷在1 ～10 μg范围内线性良好, 线性回归方程为Y=1.4191X+1.7344，线性相关系数为0.9997。

2.4 精密度和稳定性试验 精密度试验取批号为20180822芪板青颗粒供试品溶液，重复进样6次，计算绿原酸、咖啡酸和黄芪甲苷的含量，其含量RSD分别为0.6%、1.2%和1.5%；稳定性试验取上述溶液，分别于0、2、4、6、12和24 h进行测定，计算绿原酸、咖啡酸和黄芪甲苷的含量，其含量RSD分别为0.7%、1.4%和1.6%。

2.5 加样回收率试验 取绿原酸、咖啡酸和黄芪甲苷对照品适量，加甲醇配制成约1 mg每毫升的加样回收率试验溶液。添加到批号为20180822的芪板青颗粒样品中，添加的浓度与样品中原有的量相当，6个重复，按照上述方法制备供试品溶液，进行检测，结果扣除芪板青颗粒样品原有相应组分的量，计算加样回收率和RSD。绿原酸平均加样回收率为97.1%，RSD为1.3%，咖啡酸平均加样回收率96.2%，RSD为1.4%。黄芪甲苷平均加样回收率为98.0%,RSD为2.4%。

2.6 实际样品的测定 取批号为20180822、20180823和20180824的芪板青颗粒每一批做3个平行，依法测定，结果绿原酸的含量分别为0.83、0.82和0.83 mg/g；咖啡酸的含量分别为0.74、0.76和0.77 mg/g；黄芪甲苷含量分别为0.0814、0.0825和0.0835 mg/g。

1.绿原酸；2.咖啡酸1.chlorogenic acid; 2.caffeic acid图1 绿原酸和咖啡酸对照品溶液色谱图Fig 1 Chromatogram of chlorogenic acid and caffeic acid reference solution

图2 绿原酸对照品溶液光谱图Fig 2 Spectrogram of chlorogenic acid reference solution

图3 咖啡酸对照品溶液光谱图Fig 3 Spectrogram of caffeic acid reference solution

1.绿原酸；2.咖啡酸1.chlorogenic acid; 2.caffeic acid图4 供试品溶液色谱图Fig 4 Solution chromatogram of the sample

图5 黄芪甲苷对照品溶液色谱图Fig 5 Solution chromatogram of astragaloside reference substance

图6 黄芪甲苷供试品溶液色谱图Fig 6 Solution chromatogram of astragaloside IV

3 讨论与结论

3.1 提取溶剂的选择 绿原酸和咖啡酸检测中，选择了水、乙醇、甲醇和50%甲醇溶液超声和水浴回流等不同方式提取，结果表明，绿原酸在甲醇中提取效率稍低，其他几种方式均较好；咖啡酸在水超声和水回流中的提取效率比较低，其余几种方式均较好。因此，综合考虑，选择乙醇回流作为芪板青颗粒供试品的提取溶剂和提取方式。在这基础上，做了提取时间的确认，试验分别超声15、20、30和60 min，结果15 min的结果稍低，30 min以后无显著差异，因此，超声时间定为30 min。

3.2 检测波长的选择 本试验采用DAD检测器对绿原酸和咖啡酸进行全波长扫描，结果发现，绿原酸在326 nm波长有最大吸收，咖啡酸在324 nm处有最大吸收，参考《中国兽药典》2015年版二部绿原酸的测定方法，综合考虑每个药物的响应值及杂质干扰因素，选择327 nm作为检测波长。

3.3 流动相的选择 选择绿原酸和咖啡酸的流动相时，考察了乙腈与不同浓度磷酸溶液作为流动相，各流动相保留时间和峰形一致，而0.4%磷酸溶液pH值为1.5，0.2%磷酸溶液pH值为1.7，pH值小于2.0对色谱柱损害较大；而0.05%磷酸溶液pH值为2.3左右。因此，选择0.05%磷酸溶液-乙腈作为流动相，调节流动相比例，两种药物分离较好，保留时间比较合适。黄芪甲苷流动相参考《中国兽药典》2015年版二部黄芪甲苷相关内容进行检测。

3.4 ELSD条件的优化 黄芪甲苷属于在紫外区无特征吸收的化合物，而ELSD作为质量通用型检测器，不依赖样品的光学特征，不受官能团的影响。漂移管温度、雾化器温度和气流速度等是ELSD的重要参数，决定了流动相气化是否完全、响应值是否满足要求，因此实验考察了不同漂移管温度、雾化器温度和气流速度，最终得到理想的条件。

3.5 结论 采用HPLC-DAD法对芪板青颗粒中绿原酸和咖啡酸进行检测，采用HPLC-ELSD法对芪板青颗粒中黄芪甲苷进行检测，对提取溶剂、提取方式和色谱条件(检测波长、漂移管温度、雾化器温度和气流速度)等条件进行优化，方法定性定量准确，得到了满意的结果，为芪板青颗粒质量控制提供数据。