类香味细菌与巨大芽孢杆菌解离煤矸石应用研究

李夏夏，钟 艳，谢承卫

(贵州大学 化学与化工学院，贵州 贵阳 550025)

煤矸石是煤炭生产过程中产生的一种固体废弃物，大量堆放在露天空地，占用大量土地资源并对环境造成严重的污染[1-4]. 我国是世界上最大的煤炭生产和消费国，预计2020年，所占比例不低于60%，决定了煤炭资源在我国国民经济及社会发展中的重要战略地位[5]. 目前，煤矸石的主要用于生产矸石砖等，然而在实际应用中发现，由于煤矸石成份的复杂性，生产效益较低[6-7]. 因此，开发煤矸石的资源应用迫在眉睫，2010年，程勇等人[8-9]进行了煤矸石中炭的浮选及煤矸石活化的研究，将煤矸石中的炭资源化利用，进而增加煤矸石的综合利用率. 如何开发出利用率高、污染小的煤矸石综合利用技术，已成为当今研究热点之一.

寻找高效的解磷微生物是该领域研究人员关注的焦点问题之一[10]，相关研究表明，芽孢杆菌和埃希氏菌对磷酸三钙具有溶解能力，且分解能力存在较大差异[11-12]. Paul和Sundara[13]测定几株芽孢杆菌溶解磷酸三钙的效率高达19%，其中解磷能力最强的是巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，解磷微生物在矿物解离方面具有一定的应用价值. 本课题组率先将已报道的微生物细菌用于煤矸石的解离研究，获得良好的效果，其中解钾细菌、硅酸盐细菌能有效解离煤矸石中所含矿物质，将其转化为植物可吸收利用的营养元素，制备成煤矸石肥料[14]. 2015年，袁向芬等[15]发现解磷微生物巨大芽孢杆菌对高硫煤矸石具有解离作用，能将其中的营养物质释放，使高硫煤矸石的资源化利用成为可能. 煤矸石富含丰富营养物质[16]，利用解磷微生物[17-18]解离煤矸石制备肥料，解离后煤矸石肥效显著提升.

煤矸石是一种潜在的可利用资源，全国目前有数十亿吨之多，未得到有效利用，开发新型的能有效解离煤矸石的微生物细菌，是煤矸石资源化、绿色化应用的重要基础.

本研究通过广泛的煤炭产区生态环境调研，从风化煤矸石中筛选、培育出具有高效解磷效果的微生物——类香味细菌，对类香味细菌菌株进行了生理生化，并与巨大芽孢杆菌进行了煤矸石解离的对比研究，类香味菌株对煤矸石的解离效果优于传统的菌株巨大芽孢杆菌. 类香味细菌的发现，进一步扩大了解磷微生物的范围，目前类香味细菌在解磷方面的研究，还未见报道. 通过微生物解离煤矸石制备微生物复合肥料，是一种几乎无污染、成本低、工艺简单、利用率高的、新型的煤矸石应用方式. 本研究通过从风化煤矸石中筛选培养出高效解磷细菌，针对性强，解离煤矸石效果好，是一条寻找新型解离煤矸石微生物细菌的有效途径.

1 实验部分

1.1 实验原料和菌株

1.1.1 试 样

实验原料取自贵州省六盘水地区某矿区煤矸石. 该煤矸石主要矿物成分为SiO252.40%, Al2O323.07%, Fe2O312.02%, CaO 3.4%, P2O50.27%, K2O 1.52%等.

1.1.2 菌种及其培养

本实验所用菌株包括类香味菌(Myroides odoratimimus strain)以及巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium). 类香味菌从风化煤矸石中提取、培育所得，研究发现该菌株具有高效的解磷能力，以及制备煤矸石肥料的潜力. 巨大芽孢杆菌(ACCC10011)来自于中国农业微生物菌种保藏中心，是一种公认的、常用的解磷微生物.

全营养固体培养基： 蛋白胨5 g，氯化钠5 g，牛肉膏1 g，酵母膏2 g，琼脂15～20 g，蒸馏水1 000 mL，体系pH调整为7.4.

类香味菌在全营养培养基上的单菌落形态如图1 所示： 菌落呈不透明，形状边缘规则，表面湿润，中间呈现乳白，略带浅黄色，有光泽，菌落约2 mm. 经革兰氏染色镜检，菌体形态如图2 所示，菌体呈革兰氏阴性(G-)杆菌，有两两相连排列，无芽孢、鞭毛和荚膜.

图1 类香味菌落形态Fig.1 The colonial morphology of Myroides odoratimimus strain

图2 类香味菌体形态Fig.2 Mycelial morphology of Myroides odoratimimus strain

1.2 实验方法

1.2.1 菌液的制备

将培养好的类香味菌冲洗到三角瓶中，将菌液稀释为菌株浓度在(1.46×1013cfu/mL～1.87×1013cfu/mL)，塞紧瓶塞，放入恒温震荡摇床上震荡30 min，混匀待用.

1.2.2 单因素试验方法

准确称取一定量、不同粒度的煤矸石于培养皿中，加入不同浓度的菌液，搅拌均匀，用稀盐酸溶液和稀氢氧化钠溶液调节不同pH值，放入恒温培养箱培养若干天，取出烘干后，测定样品中有效磷的含量，测定方法[19]参照《土壤分析技术》.

1.2.3 正交试验

根据单因素实验结果，对两株细菌分别设计了L9(3)4正交实验，寻找类香味菌株、巨大芽孢杆菌的最佳解离煤矸石条件.

2 结果与讨论

2.1 菌株解离煤矸石单因素结果

2.1.1 体系pH值

煤矸石的粒度采用100目，接菌量浓度为1.46×1013cfu/mL～1.87×1013cfu/mL ，培养时间2 d，保持适当的干湿度，用稀盐酸溶液和稀氢氧化钠溶液调节体系pH，测定pH对解磷效果的影响.

当将体系pH值调节为5，6，7，7.5，8，9，10，测定两种菌株解离后煤矸石中有效磷的含量. 由图3 可知，当体系pH值分别约7，9时，类香味菌和巨大芽孢杆菌解离煤矸石有效磷含量达到最大. 从变化趋势可以看出，巨大芽孢杆菌对pH值变化比较敏感，波动较大，而类香味菌，随着pH值变化，对解磷效果的影响较小，可以降低工艺上调节pH值的难度. 我国大多数土壤偏酸性或中性，使得类香味菌有较好的适应能力，利用类香味菌处理煤矸石制备肥料更有实际应用价值，能够更好地改善土壤中缺磷的现象.

图3 体系pH值对有效磷含量的影响Fig.3 Effective phosphorus change with the pH value of system

2.1.2 煤矸石颗粒大小

体系pH调整为8，接入1.46×1013cfu/mL～1.87×1013cfu/mL浓度的细菌，培养时间2 d，保持适当的干湿度，测定煤矸石粒度对解磷效果的影响.

图4 煤矸石颗粒尺寸对有效磷含量的影响Fig.4 Effective phosphorus change with particle size of coal gangue

煤矸石颗粒大小不同时，测定两种菌株解离后煤矸石中有效磷的含量. 由图4 可知，煤矸石粒径逐渐变小时，类香味菌株与巨大芽孢杆菌解离煤矸石的有效磷含量呈先增大后减小的趋势，当颗粒尺寸分别为120目，40目时，有效磷含量达到最大. 但两株菌株由于自身特性，对煤矸石不同颗粒尺寸的解磷效果并不相同，类香味菌株能够在颗粒粒径适中的情况下，使得菌液更加充分解离煤矸石中的磷，增加煤矸石中磷的利用率，而巨大芽孢杆菌属于特别需氧型，颗粒尺寸减小使得煤矸石之间接触紧密，导致其中的氧气含量降低，抑制了该菌株的代谢作用. 但实际应用中，颗粒太大或太小都会对扩大生产过程产生一定的阻碍，这使得类香味菌株解离煤矸石具有更好的实际应用前景.

2.1.3 接菌量

煤矸石的粒度采用100目，培养时间2 d，体系pH调整为8，接入不同浓度的细菌，保持适当的干湿度，测定接菌量对解磷效果的影响. 向称取一定量煤矸石的培养皿中分别加入一定浓度，体积分别为5，10，15，20，25，30，40，50 mL的菌液，混匀，将其放入恒温培养箱培养2 d 左右后，取出测定其有效磷含量，如图5 所示.

图5 接菌量对有效磷含量的影响Fig.5 Effective phosphorus change with the inoculation amount

由图5 可知，对于类香味菌株而言，随着接菌量的增大，有效磷含量逐渐增大，当接菌量为50 mL时，有效磷含量达到最大. 而巨大芽孢杆菌，随着接菌量的变化，呈现先增大后减小的趋势，当浓度为40 mL 时，有效磷含量最大. 当接菌量均为 40 mL 时，类香味菌解离煤矸石的能力强于巨大芽孢杆菌，能够更高效地分解煤矸石中的难溶性的磷.

2.1.4 培养天数

煤矸石的粒度采用100目，体系pH调整为8，接入1.46×1013cfu/mL～1.87×1013cfu/mL 浓度的细菌，保持适当的干湿度，测定培养时间对解磷效果的影响. 当培养时间为1，2，3，4，5，6，7，8，9，10 d时，测定两株菌株分别解离煤矸石的有效磷含量. 由图6 可知，培养天数为3 d时，类香味菌株解离煤矸石后有效磷含量达到最大； 培养时间为1 d时，巨大芽孢杆菌解离煤矸石后有效磷含量最高. 类香味菌株解离煤矸石的能力受时间因素影响较小，表明类香味细菌有很强的生命力，能将煤矸石中的大量无效磷转化为有效磷. 而巨大芽孢杆菌，随着培养天数的不同，解离能力不同程度降低，可能由于对氧有较强的依赖能力所影响，当氧含量多时，菌株活性越强，解离效果越好，而氧含量逐渐减少，会造成部分的巨大芽孢杆菌失去活性，从而使得有效磷含量较低，表明巨大芽孢杆菌处理煤矸石具有一定的不稳定性，不能更高效地解离煤矸石中的无效磷成分. 考虑工艺生产过程、时间带来的成本，类香味菌株优先选择3 d，而巨大芽孢杆菌优先选择1 d.

图6 培养天数对有效磷含量的影响Fig.6 Effective phosphorus change with the cultured time

2.2 类香味菌解离煤矸石正交实验

2.2.1 正交实验结果

通过单因素实验，发现两种细菌解离煤矸石的四个主要因素为： 粒径大小，体系pH值，接菌量和体系的培养时间. 根据单因素实验结果，对两株细菌分别设计了L9(3)4正交实验，寻找类香味菌、巨大芽孢杆菌最佳的解离煤矸石条件和正交试验条件，结果见表 1 和表 2.

表 1 类香味菌株的正交试验以及结果

表 2 巨大芽孢杆菌的正交试验以及结果

表 1，表 2 分别为类香味细菌与巨大芽孢杆菌解离煤矸石的正交试验结果，实验结果表明，当接菌量为50 mL, 培养天数为2 d, 煤矸石粒径大小为140目以及体系pH为7的最佳实验条件下，类香味细菌解离煤矸石的解磷效果最好，其有效磷含量为50.41 mg/kg； 当接菌量为50 mL, 培养天数为3 d, 煤矸石粒径大小为20目以及体系pH为7.5的最佳实验条件下，巨大芽孢杆菌解离煤矸石的解磷效果最好，其有效磷含量为 42.21 mg/kg.

2.2.2 解磷能力比较

将类香味细菌、巨大芽孢杆菌在最佳解离煤矸石条件下，进行同一来源煤矸石解离对比试验，比较两种菌株的解离效果，结果如表 3 所示.

表 3 两种细菌最佳解磷条件及解离煤矸石结果

表 3 为最佳条件下，菌株解离煤矸石的实验结果，发现解离后有效磷含量均高于原样磷含量. 但两株细菌最佳解离条件存在差异，巨大芽孢杆菌解离煤矸石的颗粒比类香味细菌大，最佳培养时间与类香味菌相差不大，实际的工业生产中，巨大芽孢杆菌在解离效率上有优势. 从解离煤矸石结果来看，类香味细菌处理后的有效磷提升5倍左右，而巨大芽孢杆菌处理后有效磷提升4倍左右，类香味细菌的解磷效果优于巨大芽孢杆菌.

3 结 论

1) 新型解磷微生物细菌的发现，使得解磷细菌不再局限于土壤，同时具有处理煤系废弃物煤矸石的潜力. 研究表明，筛选培育得到具有高效解磷能力的类香味细菌，能有效解离煤矸石，增加其中有效磷含量. 类香味细菌解离功能的发现，拓展了解磷微生物的研究范围.

2) 正交实验结果表明，类香味菌解离煤矸石最佳条件为： 接菌量为50 mL，培养天数为2 d，煤矸石粒径大小为140目以及体系pH为7. 与传统解磷细菌巨大芽孢杆菌对比研究表明，类香味细菌的解磷效果优于巨大芽孢杆菌.

3) 采用新型细菌处理废弃的煤矸石，是一种对环境非常友好的、温和的、无污染的绿色化方法. 针对不同地域的煤矸石(或其它大宗工业废料)，开发专用的微生物细菌，使其资源化成为可能，能有效地解决煤矸石对环境的危害.