回捕牙鲆生长和摄食状况调查研究

宋立民　于清海　袁立来　司飞　任玉芹　任建功　张红涛　李楠

摘    要：以秦皇島海域回捕牙鲆为材料，应用分子标记将其分成放流和非放流2组，采用形态学测量、鉴定方法并结合DNA条形码技术对比分析了2组牙鲆的生长和摄食状况。结果显示：（1）放流牙鲆的体长和体质量略大于非放流牙鲆，肥满度、脂肪含量和肠体比值略小，经过独立样本T检验，各参数值的差异并不显著（P>0.05）;（2） 2组牙鲆的空胃率较高，摄食强度差异不显著（P>0.05）;（3）胃含物组成和种类基本一致，包括鱼类、软体动物、多毛类和虾类;（4）针对4种不可辨认的胃含物提取组织DNA，选用线粒体DNA COI基因片段作为分子标记，在Gen Bank中进行比对分析，并利用MEGA 4.0构建NJ系统进化树，结果鉴定出一种鰕虎鱼（Gobiidae sp.）、一种石首鱼（Sciaenidae sp.）、赤鼻绫鯷（Thryssa kammalensis）和火枪乌贼（Loliolus beka）。进而说明放流牙鲆经过禁渔期的适应，已经恢复了在增殖海域生存的能力。

关键词：牙鲆;增殖放流;生长指标;胃含物;DNA条形码

中图分类号： S932.4         文献标识码： A         DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.05.008

Growth and Feeding Status of the Captured Population of Paralichthys olivaceus

SONG Limin1，2， YU Qinghai2， YUAN Lilai3， SI Fei2， REN Yuqin2， REN Jiangong2， ZHANG Hongtao2， LI Nan1

（1.Tianjin Fisheries Research Institute， Tianjin 300221， China;2.Beidaihe Central Experiment Station， Chinese Academy of Fishery Sciences， Qinhuangdao， Hebei 066100， China;3.Fisheries Resource and Environment Research Center， Chinese Academy of Fishery Sciences， Beijing 100141， China）

Abstract： The captured population of Japanese flounder in the Qinhuangdao coastal releasing area were divided into two groups by molecular markers， which were the released group and non-released group. Differences of growth indexes and dietary composition between the two groups were compared and analyzed by morphological method and molecular technology. The results showed that： （1） the values of body length and weight in the released group were higher than the non-released group， while the values of condition factor and whole body crude lipid content and viserosomatic index were lower， and all of those did  not  show  any  significant  differences  between the released P. olivaceus and non-released P. olivaceus （P>0.05）; （2） high gastric vacuous rate were showed in released and non-released groups， while values of feeding intensity were not significantly different from each other; （3） stomach contents of the released P. olivaceus and non-released P. olivaceus had little differences， including pisces， mollusk， polychaeta and decapoda; （4） DNA were extracted from 4 sampled fish stomach contents which could not be identified by morphological observation， Mitochondrial DNA COI was amplified as molecular marker， comparative analysis were conducted in Gen Bank， and NJ phylogenetic trees were established by MEGA 4.0， results of a Gobiidae sp.， a Sciaenidae sp.， Thryssa kammalensis and Loliolus beka were identified. Furthermore the released P. olivaceus had pretty much adapted to the wild after the closed season.

Key words： Paralichthys olivaceus; artificial stock enhancement; growth indexes; stomach contents analysis; DNA barcoding

牙鲆（Paralichthys olivaceus）属于鲽形目、鲽亚目、牙鲆科、牙鲆属，以黄渤海区分布较多，其主要捕食底栖非经济鱼类及甲壳类，具有肉质细嫩鲜美、洄游性小、回归性强等特点[1]。由于捕捞强度的增加和环境污染的加剧，牙鲆资源显著减少[2]，为此，我国自20世纪80年代开始在渤海海域进行牙鲆的增殖放流活动[3]，并且规模逐渐扩大，目前仅秦皇岛近海每年就有数百万的牙鲆苗种被投放，已成为我国牙鲆增殖放流的主要区域之一[4]。但是在放流效果评估方面，有研究[5]表明，与高等脊椎动物相比，鱼类具有较强表型可塑性，由于传统繁育场的物理环境、生物及社群环境与自然环境截然不同，加之人工选育的影响，将使养殖群体与野生群体在生物学、行为、生态适应性和遗传多样性等方面表现出差异。目前，已有关于增殖放流对秦皇岛海域野生牙鲆遗传多样性影响方面的研究报道[4]，但还未见到有关秦皇岛海域放流牙鲆生长和摄食情况方面的调查研究，鉴于此，本研究以2015年禁渔期结束后3个月（9—11月）在秦皇岛海域回捕的当年生牙鲆幼鱼为材料，初步调查和研究了放流群体与野生群体摄食和生长方面的差异，以期为放流牙鲆生长和摄食生态方面的研究提供参考数据，并具体评估放流对象的环境适应情况，进一步指导增殖放流活动。

1 材料和方法

1.1 试验材料

从2015年9月至11月，连续3个月在秦皇岛市辖区内山海关区、北戴河区、昌黎县主要码头渔港回收捕捞牙鲆569尾，参考童爱萍等[6]方法，利用分子标记鉴别出放流个体261尾，非放流个体308尾。

1.2 试验方法

1.2.1 生长相关参数测定 用精确到0.01 g的电子天平测量样本鱼体质量（W），对鱼体拍照后，采用Motic Images Plus 2.0软件测定鱼体长（L）。肥满度（CF）的计算公式为（CF）=（W/L3）×100，采用索氏抽提法（GB 5009.6-2016）测定全鱼脂肪含量。

1.2.2 肠体比测定 主要参考王青林等[7]方法，具体操作如下：解剖样本，剪取完整消化道装袋，称质量并编号，冷冻待测。对消化道进行称质量时，先用滤纸吸去表面水分，然后用电子天平（精度0.01g）称量。肠体比（VI）按照以下公式计算：VI=100%×Wi/W，

其中，Wi为肠质量（g）;W为鱼体质量（g）。

1.2.3 摄食强度判断 参考纪东平等[8]方法根据胃的饱满程度将摄食等级分为0～4级：0级，胃中无食物;1级，胃中有少量 （<1/2） 食物;2级，胃中有适量（≥1/2）食物;3级，胃中充满食物，但胃壁不膨大;4级，胃中充满食物，并且胃壁膨大。

1.2.4 胃含物分析 方法参考纪东平等[8]。采用形态学观察，主要针对食物当中不易消化或未被消化部分，如鱼类耳石、骨骼、虾类额剑等，利用解剖镜、显微镜等工具鉴定食物种类，计算饵料出现频率;公式如下：

出现频率=某饵料生物出现次数/总胃数×100%

采用DNA条形码鉴定，具体操作介绍如下：针对形态上不能准确鉴定的食物团置于无水乙醇中保存，用于DNA條形码鉴定。

（1） DNA提取。取相对完整的样品组织20～30 mg，使用海洋动物基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN，DP324）提取基因组DNA。提取完成后，采用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计分别检测DNA的质量和浓度。

（2） 线粒体DNA COI基因片段扩增。鱼类和虾蟹类使用的引物名称、引物序列、退火温度等见表1，引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。PCR反应体系为20 μL，包括dH2O 7.4 μL，2×Es Taq MasterMix 10 μL，上下游引物（10 pmol·μL^-1）各0.3 μL，DNA模板2 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性45 s，52 ℃复性45 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环;最终72 ℃延伸10 min。取2 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，使用回收试剂盒对目的条带进行回收和纯化，之后送生物公司进行正反链测序。

（3）序列分析。使用DNASTAR软件包对测得序列进行编辑和人工校正;使用NCBI的BLAST进行序列比对分析;通过MEGA 4.0构建邻接关系树，并计算遗传距离。

2 结果与分析

2.1 生长情况

回收所得两类样本之间各参数值见表2，放流牙鲆的体长和体质量平均值略大于非放流牙鲆，肥满度、脂肪含量和肠体比值略小，独立样本T检验结果表明参数值差异不显著（P>0.05）。

2.2 摄食强度

放流牙鲆和非放流牙鲆样本的摄食情况如表3，摄食强度均以0级所占比例最高，占到84%，1级占13.28%，2级占2.38%，罕见饱食个体，2组样本测定数据差异不显著（P>0.05）。

2.3 胃含物组成

回捕牙鲆样本的食物组成见表4。除放流牙鲆摄食大泷六线鱼和蛇尾外，2组牙鲆所摄食其他食物种类基本相同，包括鱼类、软体动物、多毛类和虾类。按出现频率来分，放流牙鲆摄食种类依次为鱼类、软体动物、虾类、多毛类和蛇尾;非放流牙鲆摄食种类依次为鱼类、虾类、多毛类和软体动物。鱼类出现频率最高，分别为82.78%（放流牙鲆）和72.85%（非放流牙鲆）。

2.4 利用DNA条形码鉴定不可辨认牙鲆饵料生物种类

分析饵料生物组成的过程中，发现4种胃含物样本，包括3种鱼类和1种头足类，采用形态学方法无法具体分辨其为何种。利用DNA 条形码进行鉴定的结果如图1。

对样本1中不可辨认鱼类扩增得到COI序列的长度为680 bp，BLAST分析相似性最高 （99%） 的相关序列及对应物种是HQ711866.1 （Chaeturichthys stigmatias）、HQ711875.1（Acanthogobius  hasta）、JN242585.1

（Oxyurichthys tentacularis）和JQ343912.1 （Rhinogobius maculafasciatus），下载序列与样本比对，遗传距离分别为0.005，0.007，0.005和0.005。邻接关系树显示，样品1与他们聚为一支。因此认定样品1是鰕虎鱼科中的一种 Gobiidae sp.。

对样本2中不可辨认鱼类扩增得到COI序列的长度为679 bp，BLAST分析相似性最高 （99%） 的相关序列及对应物种是HM180638.1（Larimichthys crocea）、HQ711868.1（Johnius belangerii） 和KX777972.1 （Johnius heterolepis），与样品2的遗传距离分别为0.015，0.010，0.015。邻接关系树显示，样品2与他们聚为一支。因此认定样本2是石首鱼（Sciaenidae sp.）中的一种。

对样本3中不可辨认鱼类扩增得到COI序列的长度为677 bp，BLAST分析相似性最高 （100%） 的相关序列是KP403952.1 （Thryssa kammalensis）。下载相似度临近序列EF607589.1（Thryssa hamiltonii）、KP403952.1（Thryssa kammalensis）和KU942838.1（Thryssa chefuensis）与样本比对，遗传距离分别为0，0和0.002。邻接关系树显示，样品4与EF607589.1（Thryssa hamiltonii）、KP403952.1（Thryssa kammalensis） 聚为一支。结合表4中形态学鉴定结果，认定样本3可能为赤鼻棱鳀 （Thryssa kammalensis）。

对样本4中不可辨认头足类扩增得到COI序列的长度为676 bp，BLAST分析相似性最高 （99%） 的相关序列及对应物种是HQ529509.1（Loliolus beka）。下载相似度临近序列HQ529509.1（Loliolus beka）和HQ529522.1（Loliolus japonica）与样本比对，遗传距离分别为0.008和0.112。邻接关系树显示，样品4与HQ529509.1（Loliolus beka） 聚为一支。因此，认定样品4 可能是火枪乌贼（Loliolus beka）。

3 结论与讨论

3.1 生长方面

水生动物增殖放流对野生种群破坏后资源的恢复具有重要的意义，也是目前国内外进行资源修复的主要措施[9-10]，但是人工培育环境与野生环境条件是有差别的，如光照、海流、底质、敌害生物等环境条件的变化会对放流对象的摄食和生长产生一定的影响。

放流牙鲆与自然海域的同年牙鲆相比，起始培育时间较早且培育水温高，因此其体长和体质量值都较高。放流后，由于增殖海域的环境异于人工培育环境，在进入新的生存环境初期，鱼总会有一个被胁迫和逐步适应的过程，该阶段摄食水平一般较低，生长会略受影响[11-13]，因此会造成放流牙鲆与非放流牙鲆生长略有差异但数值差异性不显著的结果。肠体比在一定程度上反映了个体对饵料的吸收和消化能力[14]，肠体比小，自然会影响放流鱼的生产性能和采食量[15]，造成能量积累效率低，个体肥满度和体脂肪含量偏低。不过鉴于放流牙鲆与非放流牙鲆生长参数值比较接近，说明放流牙鲆经过休渔期，已经基本上适应了自然环境，所以研究结果与韩现芹等[16]、胡盼[17]存在不同。

3.2 DNA条形码在胃含物鉴定中的应用

对于特征明显的样品，采用形态学方法能够直接、迅速得出结果;但是如果样品量达不到标准或者特征不明显就有可能误诊或者漏诊，造成结果不准确、不全面。结合DNA条形码技术，就克服了上述缺点，并且2种方法的结合能够提供更多的种类信息[18]。

DNA 条形码（DNA barcoding）是一种基于分子生物学技术进行物种鉴定的新方法，在进行胃含物传统的形态学分析过程中，结合此技术进行有针对性的鉴定，具备比较大的应用潜力[19]。现已有国内外学者将DNA条形码技术应用到食性分析中，并取得较好效果[8，19-24]。在本次胃含物样本分析过程中为了解决在形态分析上面临的困难，采用了DNA条形码技术，同样得到了较圆满的结果。

DNA条形码技术优势主要表现在，能够鉴定出现存量较少、不完整的样本种类，且操作简便，适用范围广，准确率较高，但是此方法依赖于物种鉴定和分类相关DNA序列的数据积累[19，25]。另外，DNA条形码仅能满足于定性鉴定的要求，不能达到定量分析的目的，因此还需要结合形态学观察进行定量分析，才能得到较完整的食性分析结果[18]。

3.3 摄食情况分析

调查结果表明回捕牙鲆空胃率较高，参照龚玉艳等[26]对南海鸢乌贼摄食习性的分析方法，表明牙鲆在采样前一段时间内，该海域可供牙鲆摄食的饵料生物量比较少，或者环境有过剧烈的波动，也可能由于放流时间和放流活动过于集中，而牙鲆游动扩散能力较弱[17]，造成区域内食物量相对偏少，这也是一段时间内牙鲆肥满度偏低的原因。

有关牙鲆的食物组成，刘婵馨和秦克静[27]认为其食物种类广泛，以鱼类为主，其次为虾类、蟹类、软体动物、环节动物和棘皮动物等;窦硕增和杨纪明[28]认为渤海南部牙鲆的食性同样以鱼类为主，软体动物及甲壳类居其次，海葵类为偶然性食物。显然，牙鲆是捕食性（游泳生物食性）鱼类，本次研究结果同样表明牙鲆的主要食物为鱼类，但是具体餌料鱼的种类上是有区别的，经过调查和鉴定，饵料鱼主要是矛尾虾虎鱼、小黄鱼、叫姑鱼等，而窦硕增和杨纪[28]报道为斑鰶、鳀鱼、黄鲫、六丝矛尾虾虎鱼及焦氏舌鳎等，另外，鉴定结果胃含物中也没有发现棘皮动物和海葵，这有可能是样本生长阶段差异或者饵料丰度和种类不同影响所致。