尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种的磷酸化应激诱导蛋白1（FoSTIP1）基因的克隆及表达分析

齐兴柱 汪军 刘磊

摘  要  本研究克隆了尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种（Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4， Foc4）转录因子FoSkn7一个候选的下游基因，结果表明该基因cDNA编码序列全长1737 nt，编码一个含578个氨基酸残基的蛋白质。对其编码的蛋白進行了结构域和进化分析，结果表明该蛋白质含有胁迫诱导蛋白（stress-in-ducible protein-1， STI1）结构域和多个三角形4肽重复序列结构域（tetratricopeptide repeat， TPR）。该蛋白质与尖孢镰刀菌番茄专化型的磷酸化应激诱导蛋白1（STIP1）亲缘关系最近，因此初步将其确定为Foc4的磷酸化应激诱导蛋白并命名为FoSTIP1。采用相对荧光定量PCR方法分析了该基因在野生型B2菌株入侵香蕉苗根部及在外源H2O2诱导情况下的表达变化，也分析了FoSKN7基因缺失突变体中该基因在外源H2O2诱导情况下的表达。结果表明在入侵香蕉苗根部及在外源H2O2诱导情况下，B2菌株中的FoSTIP1表达均有上调，而FoSKN7基因缺失突变体中FoSTIP1即使有H2O2诱导，其表达也远低于B2菌株中的FoSTIP1。推测FoSTIP1可能是FoSkn7的靶基因并参与了Foc4抗外源氧化胁迫。

关键词  尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种;磷酸化应激诱导蛋白;表达特性

中图分类号  S432.4      文献标识码  A

当细胞面临各种环境胁迫时，细胞内热休克蛋白基因被激活并表达，导致热休克蛋白大量产生。热休克蛋白主要作为分子伴侣参与到蛋白质的折叠、转运及组装等过程，能恢复或加速清除细胞内已变性的蛋白质进而稳定细胞结构[1]。近年来的研究表明，分子伴侣如Hsp70和Hsp90生物功能的发挥受到各种辅助伴侣分子的调控。磷酸化应激诱导蛋白（stress-inducible protein 1， STIP1）是迄今为止研究最为广泛的辅助伴侣分子，也被称为热休克蛋白70/90组织蛋白[heat shock protein （HSP） 70/90 organizing protein， HOP]，是一个62.6 ku蛋白，有9个三角形4肽重复结构域和一个核定位信号（NLS）[2]。该蛋白能够直接与Hsp70和Hsp90相结合，并且作为连接体分子，把细胞质中的Hsp70-client蛋白复合物转运到Hsp90上[3]。STIP1的TRR结构域在Hsp90伴侣机制中参与Hsp70和Hsp90的结合[4]。这种蛋白质复合物参与了多种细胞过程，包括转录、蛋白质折叠、蛋白质转运、病毒复制、信号转导和细胞分裂[5-6]。核定位信号序列允许STIP1在细胞周期蛋白激酶的控制下从细胞质运输到细胞核[2]。

然而，作为一个热休克蛋白的辅助伴侣分子，除了酿酒酵母中报道过STIP1[7]之外，目前在植物和真菌中，无论国内还是国外的文献中都未见关于STIP1的报道。

Foc4是香蕉枯萎病的强致病性病原菌，这种病原菌对海南省乃至我国香蕉种植业造成了重大影响。本实验室在研究Foc4抗外源氧化胁迫的转录组测序数据过程中获得了一个候选的cDNA片段与已报道STIP1基因高度同源[7]，同时发现在FoSkn7转录因子缺失突变体中，该基因的表达大幅下调。因此，笔者将该预测基因命名为FoSTIP1，并对其进行了克隆鉴定和表达分析，为进一步开展该类蛋白作用机理研究提供基础。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  实验用菌株和香蕉苗  Foc4的野生型B2菌株分离自海南省乐东县香蕉枯萎病病株，由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所提供。FoSKN7基因缺失突变体由本实验室制备。袋装巴西蕉（Musa AAA， Cavendish cv. Brazil）组培苗购自海南省儋州市组培中心。

1.1.2  试剂、引物及培养基  植物总RNA提取试剂盒，PCR Mix反应混合物，反转录试剂盒[FastKing RT Kit （With gDNase）]和荧光定量PCR试剂盒[Talent qPCR PreMix （SYBR Green）]均为北京天根生化科技有限公司的产品。PCR引物（表1）由上海生工生物科技有限公司合成。真菌菌株的培养采用葡萄糖-马铃薯培养基（potato- glucose-agar medium， PDA; potato-glucose-dextrose broth medium， PDB）。香蕉苗采用自来水培养。

1.2  方法

1.2.1  菌株及香蕉苗培养方法  为了提取H2O2处理的菌体总RNA，将Foc4野生型B2菌株及FoSKN7基因缺失突变体于PDB液体培养基中培养6 d，然后在超净工作台中用6层擦镜纸过滤培养物并收集滤液（即孢子液）然后按孢子与液体PDB培养基为1∶50的比例将孢子液接种到新的PDB培养基中，28 ℃、120 r/min振荡培养12 h，然后加入H2O2至终浓度10 μmol/mL，继续振荡培养5 h收集菌体，液氮研磨，提取总RNA。将袋装香蕉组培苗转入透明塑料杯中，自来水室温培养10 d左右直到香蕉苗长出幼嫩的白根，再将苗转入新的塑料杯，并加入如前所述培养12 h的B2菌株，继续室温放置24 h，收集菌体及香蕉苗根的混合物，液氮研磨，提取总RNA，检测目的基因在病原菌入侵香蕉苗根部时的表达变化情况。为了检测目的基因在FoSKN7基因缺失突变体菌株中的表达差异，突变体和B2菌株分别用H2O2（5和10 μmol/mL）处理5 h后再提取总RNA。

1.2.2  FoSTIP1基因组编码区、启动子和cDNA序列的克隆及生物信息学分析方法  利用Foc4的FoSKN7基因缺失突变体菌株转录组信息获得了1个表达下调明显的热休克蛋白基因的cDNA信息。利用该cDNA信息在NCBI网站查找同源序列的方法，获得了一段与Foc4有较高同源性的水稻恶苗病菌（Fusarium fujikuroi IMI 58289 ）的基因組序列（GenBank登录号： HF679023.1），以此序列为模板设计了2对引物（表1），分别用于PCR扩增目的基因的基因组序列及其上游启动子区的序列。利用其cDNA序列信息在其起始密码子和终止密码子附近设计2对引物（表1），并以10 μmol/mL H2O2诱导5 h的总RNA反转录的cDNA为模板，采用镶嵌PCR方法扩增、克隆并测序Foc4的STIP1基因的cDNA序列。利用目的基因的cDNA序列预测的蛋白质序列在NCBI中进行结构域分析并查找了其他物种中与该蛋白质序列类似的蛋白。参考相关文献[8-9]分析了启动子序列中FoSkn7转录因子可能的结合位点。

所应用的生物信息学分析软件包括：NCBI blast在线软件http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. Cgi;NCBI结构域预测在线软件CDD http：//www. ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi。基因结构在线预测软件softberry：http：//linux1.softberry. com/。Clustal X软件对Foc4的STIP1蛋白序列及所获得的同源蛋白序列进行多重序列比对，以鉴定它们之间的同源性;MEGA 10软件对所获得的序列构建了邻位相接的系统发育树，并用Bootstrap方法（Bootstrap method; model： P-distance; 1000 replicates; seed=64238）对该树进行分析。

1.2.3  实时荧光定量PCR分析基因表达  按植物总RNA提取试剂盒说明书提取处理后菌株的总RNA，然后反转录获得cDNA第一链，利用荧光定量PCR试剂盒[Talent qPCR PreMix （SYBR Green）]进行相对荧光定量PCR分析，所用引物为：5-STyg、3'-STyg，5-Actin、3-Actin（表1）。PCR反应体系按照荧光定量PCR试剂盒说明书配制。PCR反应在BIO-RAD公司的Mini OpticonTM Rreal-Time PCR System上进行。PCR热循环条件如下：94 ℃变性30 s;退火温度设梯度温度48～50 ℃，并退火15 s;72 ℃延伸15 s;然后读取荧光值，重复40个循环;最后从45～90 ℃，每隔0.2 ℃读取溶解曲线荧光值，每读数一次，停留2 s。运行完毕后，从Opticon Monitor 3.1软件读取C（t）值，以β-actin基因作为内参对照，检测目的基因在野生型菌株入侵香蕉苗以及H2O2处理时的表达水平时，采用2ΔC（t）法计算，检测目的基因在FoSKN7基因缺失突变体菌株中的表达水平时，采用2ΔΔC（t）法计算目的基因的相对表达水平。

2  结果与分析

2.1  FoSTIP1基因的克隆、序列分析及蛋白质产物结构分析

在筛选Foc4抗外源氧化胁迫的功能基因的过程中获得了一个候选基因（命名为FoSTIP1）的cDNA片段，通过输入Genbank进行blast比对，发现与水稻恶苗病菌（Fusarium fujikuroi IMI 58289，基因组登录序列号：HF679023.1）高度同源。因此，以该水稻恶苗病菌同源序列为模板，设计引物扩增成功获得了FoSTIP1的基因组编码区序列及上游启动子序列，其中，基因组编码区序列的PCR扩增产物长2113 nt，上游启动子序列PCR扩增产物长2221 nt，2个DNA片段部分重叠，测序后经序列比对分析，最终鉴定该基因组编码区序列1902 nt， 上游启动子序列1501 nt。经与水稻恶苗病菌基因组相应序列比对，同源性达90%，将该序列递交到GenBank，获得登录序列号：MG742355。

将上述克隆及测序获得的FoSTIP1基因组序列信息输入到softberry基因结构预测网站，选择了4个物种模式（Fusraium， Glarea_lozoyensis， Grosmannia_clavigera和Fusraiumgraminearum）预测转录序列，结果发现，以前3个物种模式为参照，预测的转录起始位点存在差异，但参照3个物种模式均预测到一个长1737 nt的ORF，编码一个由578个氨基酸残基组成的蛋白质，预测该蛋白质等电点pI=5.50，分子量为64.35127 ku，将该ORF序列与FoSTIP1（转录组测序编号为Gene5608）的cDNA序列进行BLAST比对，结果完全相同。利用该ORF序列，在其起始密码子和终止密码子附近设计引物（表1），并以10 μmol/mL H2O2诱导5 h的总RNA反转录的cDNA为模板，PCR扩增、克隆及测序获得了该基因ORF的cDNA序列。经BLAST比对发现该ORF的cDNA序列与预测的cDNA序列一致，其长度为1737 nt。将该序列递交到GenBank，获得登录序列号：MG742356。将以Fusraium物种模式作参考预测的转录序列与前面得到的上游启动子序列及基因组编码区序列比对，发现FoSTIP1在基因组上有4个外显子，3个内含子（图1）。其中，内含子1长59 nt，内含子2为53 nt，内含子3长52 nt。

FoSTIP1的结构域分析表明C末端含有一个典型的胁迫诱导蛋白（stress-in-ducible protein-1，STI1）结构域，多个三角形4肽重复序列结构域（tetratricopeptide repeat，TPR）（图2）。

笔者搜索了NCBI的基因组数据库，获得了其他真菌中11个磷酸化应激诱导蛋白1的蛋白序列。将所获得的蛋白序列与我们克隆获得的Foc4的FoSTIP1的蛋白序列一起用MEGA7.0 软件构建了邻位相接树（图3）。进化树分析表明，该蛋白质与尖孢镰刀菌番茄专化型的磷酸化应激诱导蛋白1（STIP1）亲缘关系最近（图3）。

2.2  FoSTIP1在外源氧化脅迫及入侵香蕉苗根部时的表达

在前期工作中，我们分别对Foc4在H2O2 （10 μmol/mL）处理5 h及入侵香蕉苗根部24 h的B2菌株进行了转录组测序，数据分析发现，在未经外源H2O2处理的B2菌株样品中，检测到FoSTIP1转录本为2037，而经外源H2O2（10 μmol/mL）处理5 h的B2菌株样品中，FoSTIP1转录本为5190，二者比较，log2（FC）=1.047286，表达上调。log2（FC）表示两样品间基因转录本差异倍数（Fold Change）的对数值，用于衡量表达量差异的大小，log2（FC）>0即为表达上调。在入侵香蕉苗根部24 h的B2菌株样品中，检测到FoSTIP1转录本为4197，与未经处理的B2菌株样品中FoSTIP1转录本数量比较，log2（FC）=1.042924，表达上调。

为了验证转录组测序数据的可靠性，采用半定量RT-PCR技术分析了上述2种条件下FoSTIP1的表达。分析以β-actin基因作为内参对照，采用2ΔC（t）法计算。结果如图4所示，与转录组测序结果一致。其中，在外源H2O2（10 μmol/mL）处理5 h的B2菌株中FoSTIP1的表达量约为对照样品中的2.201倍，入侵香蕉苗根部24 h的B2菌株中，FoSTIP1的表达量约为对照样品中的1.878倍（图4）。

2.3  FoSTIP1调控机理的初步分析

分析Foc4的FoSKN7基因缺失突变体菌株转录组测序结果发现，在FoSKN7基因缺失突变体菌株中检测到FoSTIP1转录本为287，而野生型B2菌株样品中，FoSTIP1转录本为2217，二者比较，log2（FC）= 2.97505，表达下调显著。半定量RT-PCR分析结果如图5所示，在用5 μmol/mL H2O2处理5 h的情况下，FoSKN7基因缺失突变体中FoSTIP1的相对表达量约为野生型B2菌株2/3，在用10 μmol/mL H2O2处理5 h的情况下，FoSKN7基因缺失突变体中FoSTIP1的相对表达量约为野生型B2菌株1/3。表明即使有外源氧化胁迫存在的情况下的情况下，FoSKN7基因缺失突变体中FoSTIP1的表达量相对B2菌株也大幅下调。

He等[8]报道了Skn7能结合到其靶基因（氧化胁迫应答基因）启动子区特异结合位点（5'-GGCNNGGC-3'， 5'-GGCNGGC-3'， 5'-GGCN A A-3'， 或5'-GGCNNAGA-3'）。Morgan等[9]也报道了Skn7 能结合到其靶基因启动子区结合位点（5'-CCG AAA-3'）。参考酿酒酵母中Skn7转录因子结合的碱基序列[10-11]，我们进一步分析了FoSTIP1基因上游的启动子序列。结果发现FoSTIP1基因上游的启动子含有2个可能的Skn7转录因子结合靶位点：5'-CCGAAA-3'（-1490），5'-GGCGAGA-3' （-770）（图6）。

3  讨论

植物对病原菌入侵的最快防卫反应之一就是活性氧的急促释放，称为氧化爆发（oxidative burst），这种现象在植物抵抗病原菌入侵过程中具有重要作用。前期的研究工作中，我们发现Foc4在入侵位点会遭遇寄主细胞因活性氧迸发而产生的强氧化胁迫环境。因此，分别对H2O2处理过的以及香蕉苗根诱导过的Foc4野生型B2菌株，进行了转录组测序，以探究Foc4遭遇外源氧化胁迫时的分子应对机制。同时，还对一个Foc4的FoSKN7基因缺失突变体进行了转录组测序。发现FoSKN7PCR反应进行3次重复。

基因缺失突变体中一个热休克蛋白基因（磷酸化应激诱导蛋白1，FoSTIP1）表达下调显著。因此对该基因进行了克隆鉴定，基因结构分析，启动子分析。并利用实时荧光定量PCR方法对其在外源氧化胁迫存在条件下及菌株入侵香蕉苗根部条件下的表达进行了分析。考虑到热休克蛋白作为细胞内的保护性蛋白，是一类提高细胞应对外界环境胁迫能力的蛋白质。热休克蛋白能与很多蛋白质分子结合，发挥多种生理功能：帮助氨基酸链折叠成正确的三维结构，清除受损而无法正确折叠的氨基酸链，护送蛋白分子寻找目标分子以免受到其他分子的干扰等，从而减轻各种极端环_  标记为Skn7的可能结合靶位点，其中“ATG ”为FoSTIP1开放阅读框的起始密码子。

境条件如高温、干旱、强氧化胁迫、UV线照射等对细胞的损害。所以，当细胞面临各类环境胁迫时，第一反应就是引起多种热休克蛋白表达上调[11]。与此相一致，本研究中FoSTIP1在外源氧化胁迫及香蕉苗根部诱导条件下的表达均大幅上调。在高等哺乳动物体内，STIP1也是一个重要的分子伴侣，其两端分别与Hsp70和Hsp90相连，对于肿瘤细胞发生、胁迫反应和细胞增殖分化等均具有重要的调节作用。目前，STIP1作为卵巢癌发生的一种新的标志物被广泛研究和报道[12-14]。但是在植物和真菌中，除酵母以外未见有关于STIP1功能研究的报道。

考虑到Skn7转录因子是一个调控多种热休克蛋白质的转录因子，其蛋白质包含一个N-末端的热休克转录因子DNA结合结构域（heat-shock transcription factor-like DNA-binding domain）和一个C-末端的应答调节受体结构域（response regulator receiver domain）[15]，而FoSKN7的基因缺失突变体中FoSTIP1的表达大幅下调以及FoSTIP1启动子区存在的可能的FoSkn7结合位点表明FoSTIP1是FoSkn7可能的靶基因。

綜上所述，本研究的结果暗示FoSTIP1可能参与了Foc4抗外源氧化胁迫，原因如下：1、荧光定量PCR表明，在有H2O2诱导的情况下FoSTIP1基因表达上调。2、由于Foc4在入侵位点会遭遇寄主细胞因活性氧迸发而产生的强氧化胁迫环境，香蕉苗诱导的情况下FoSTIP1基因表达上调可能与寄主细胞中活性氧（ROS）物质的含量增加有关。3、酵母和多种丝状真菌中的研究表明Skn7转录因子是参与抗外源氧化胁迫信号通路的的重要一环[10]，而转录组测序、荧光定量PCR及启动子分析均证明FoSTIP1是FoSkn7的可能的靶基因。热休克蛋白质的主要功能即为参与生物细胞应对外界环境胁迫[16]，而作为一种热休克蛋白质，FoSTIP1也可能参与这些过程。

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