细胞壁蔗糖转化酶活性上调对番茄果实和种子生长发育的不同影响

辛曙丽 郭德胜 赖涵旸 刘永华

摘  要  以T4代的轉基因番茄为材料，研究细胞壁蔗糖转化酶（CWIN）活性上调对番茄果实和种子发育的不同影响。结果发现，CWIN活性上调增加了单果鲜重，但单果种子数量、发芽势和发芽率显著下降，表明CWIN在促进番茄果实生长发育的同时，抑制了种子的生长发育。进一步的生理生化指标测定表明，造成上述现象的可能原因有2个：①CWIN活性上调导致果实中储存的淀粉含量下降，同时己糖（葡萄糖和果糖）含量显著上升，表明转基因果实利用过剩光合产物所积累的淀粉的能力增强，从而可以利用的糖分增加，但这些糖分主要被用于果实的生长发育和果实己糖的积累，而不是用于种子生长发育。②CWIN活性上调还导致果实中的叶绿素含量下降，推测这可能会导致果实的光合作用下降，从而造成种子生长发育得不到充足的糖分供应，因而生长发育受到抑制。总之，CWIN活性上调可抑制种子发育和促进果实发育，这将为进一步提高番茄的产量和品质提供一种新的思路和方法。

关键词  番茄;细胞壁转化酶;蔗糖代谢;果实;种子中图分类号  S641.2      文献标识码  A

Differential Effects of Up-regulation of Cell Wall Invertase Activity on Fruit and Seed Development in Tomato

XIN Shuli²， GUO Desheng¹， LAI Hanyang¹， LIU Yonghua^1*

1. Institute of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Administration Bureau of Agricultural Technology of Lingshui， Lingshui， Hainan 572400， China

Abstract  The T4 transgenic tomato with elevated CWIN activity was employed to study the effects of CWIN on seed and fruit development. It was found that the elevated CWIN activity resulted in increased fresh weight per fruit， but decreased seed number per fruit， seed germination rate and germinability. These results showed that although the development of fruit was enhanced by the elevated CWIN activity， the development of seed was impaired. Further investigations at physiological level revealed two possible reasons for the above-stated phenomenon： ①The elevation of CWIN activity led to decreased starch content and increased hexose （i.e. glucose and fructose） content， indicating there was enhanced capability of transgenic fruits in utilizing photo-assimilates， which facilitating the development of fruit and the hexose accumulation in fruit， instead of the development of seed. ②The elevation of CWIN activity also resulted in decreased content of chlorophyll in fruits， implying decreased photosynthetic activity of fruit and thus inhibiting seed development due to inadequate supply of photo-assimilates to seed from fruit photosynthesis. Altogether， the elevation of CWIN activity inhibited the development of seed， but promoted that of fruit， which could provide a new pathway to increase the yield and quality of tomato.

Keywords  tomato; cell wall invertase; sucrose metabolism; fruit; seed

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.01.009

蔗糖分解代谢在种子和果实发育中发挥着重要的作用，是决定种子和果实产量与品质的重要因素^[1-2]。蔗糖及其分解产生的己糖（葡萄糖和果糖）不仅为果实和种子的发育提供碳骨架和能量，而且也作为信号分子通过调控不同基因的表达从而影响果实和种子的生长发育进程。

植物体内有2种分解蔗糖的酶：蔗糖合成酶（sucrose synthase，Sus）和蔗糖转化酶（sucrose invertase，INV）。其中Sus将蔗糖分解为UDP-葡萄糖和果糖，而INV将蔗糖水解为葡萄糖和果糖^[3]。根据亚细胞定位的不同，INV可进一步划分为3类：细胞壁转化酶（cell wall invertase，CWIN）、液泡转化酶（vacuolar invertase，VIN）和细胞质转化酶（cytoplasmic invertase，CIN）^[4]。研究表明，CWIN是影响种子和果实发育的重要蔗糖分解酶之一。例如，玉米胚乳中CWIN基因的突变导致其活性下降以后，胚乳中的细胞分裂和膨大受到抑制，表现为种子皱缩变小^[5-6]。水稻中的CWIN基因GIF1是控制种子灌浆过程的关键基因，GIF1的突变导致种子变小、垩白增加，产量和品质均出现下降^[7]。通过RNA干扰技术抑制番茄果实中主要CWIN基因Lin5的表达导致落花落果率增加，果实产量下降^[8]。CWIN抑制因子是一種小分子蛋白质，可以和CWIN蛋白结合从而降低CWIN的活性。通过减少CWIN抑制因子表达的方式来增加CWIN的活性则可增加番茄在热胁迫下的座果率和产量^[9]。然而，前人的研究仅仅孤立地关注CWIN活性变化对果实或种子生长发育的影响，很少同时关注果实和种子的生长发育，特别是两者的均衡发育和相互影响的问题。

果实和种子的发育之间存在着复杂的相互作用。一方面，种子可提供果实生长发育所需的激素，而果实将种子包裹起来，为其种子生长发育提供保护和养分^[10]。另一方面，在果实和种子这2个器官之间还存在显著的养分竞争关系。例如，对菜豆豆荚发育的研究表明，在豆荚发育初期，荚壁（果实）与种子对蔗糖的吸收利用存在显著的竞争关系，只是到了豆荚发育的后期，荚壁中的养分才重新进行分配进入种子，促进种子的生长^[11]。在羽扇豆荚壁和种子的发育中也观察到类似的养分竞争关系，对35个羽扇豆品种的研究表明，荚壁在豆荚中所占的比重越大，则最终种子的产量越低，即荚壁和种子生长量之间呈显著负相关^[12]。因此，在全球粮食产量增长已达到平台期很难进一步提升的大背景下，对种子或果实生长发育进行有目的的调控有望进一步提高全球粮食产量。

本研究以番茄为模式植物，通过RNA干扰技术（RNAi）降低CWIN抑制因子的表达来提高CWIN的活性，然后研究其对番茄果实和种子生长发育的不同影响及其相关作用机理，从而为进一步提高粮食产量提供新的思路和理论依据。

1  材料与方法

1.1材料

实验材料为新疆农业科学院园艺研究所育成的番茄品种‘新番2号，Jin等^[13]利用RNA干扰技术下调该番茄中CWIN抑制因子的表达，从而提高了植株中的CWIN活性。2017年3月28日将T4代转基因种子播种于海口市海南大学实验基地温室内。5月10日定植于栽培盆内（盆高35 cm，上口径29 cm），每盆1株番茄，野生型和转基因植株各8盆。盆中的基质配比为土∶椰糠∶腐熟羊粪=1∶1∶2，并混合适量复合肥（N∶P∶K=15∶15∶15）。6月8号开始进行开花挂牌，以记录和确认每个果实的发育时期。

1.2 方法

1.2.1  番茄果实相关指标的测定  ‘新番2号属于有限生长型的早熟番茄品种，植株在结3串果后封顶，果实在花后40 d左右基本达到成熟期。记录每株番茄成熟果实的单果鲜重和单株果实鲜重。

1.2.2  番茄种子相关指标的测定  番茄果实达到红熟期后进行采摘，经过7 d后熟后将种子从果实中取出、洗净并晾干，分别测定单个果实中种子的数量、种子千粒重。

种子发芽率和发芽势的测定：将单株番茄上的种子混合，随机选取100粒种子进行发芽实验。首先将种子在70%酒精中浸泡、振荡1 min，然后在稀释40倍的8%次氯酸钠溶液中浸泡5 min。把消过毒的种子放于培养皿中，在恒温28 ℃的条件下进行催芽，记录第3天发芽的种子数并计算其发芽势，以第7天的发芽数计算其最终的发芽率。

1.2.3  番茄果实中CWIN活性、可溶性糖和淀粉含量的测定  本研究取花后25 d的果实用于CWIN活性的测定，具体参照Tomlinson等^[14]的方法。取花后10、25和40 d的番茄果实进行CWIN酶可溶性糖和淀粉含量的测定（均以鲜重计）。蔗糖、葡萄糖、果糖含量测定参照King等^[15]的酶学方法。淀粉含量的测定参考Smith等^[16]的酶学测定方法。

1.2.4  叶绿素含量的测定  参考李蒙等^[17]的方法，采用乙醇、丙酮、水混合液浸提叶绿素，然后利用分光光度计测定花后25 d番茄果实中的叶绿素含量，以鲜重计。

1.3 数据处理

利用Excel 2003软件对数据进行t-test分析。

2  结果与分析

2.1 CWIN活性上调对果实数量和大小的影响

果实的数量和大小共同决定番茄的最终产量，因此首先测定了CWIN活性上调对番茄花后40 d果实数量和大小的影响。结果发现，转基因番茄（RNAi）和野生型番茄（WT）虽然在单株果实数量上没有显著差异（图1A），但转基因番茄单个果实的鲜重显著高于野生型番茄（图1B）。花后25 d果实中CWIN活性的测定结果表明，转基因果实的CWIN活性显著高于野生型果实（图1C）。上述证据表明，CWIN活性的上调促进了番茄果实的生长发育。

2.2 CWIN活性上调对番茄果实可溶性糖和淀粉含量的影响

本研究所采用的番茄‘新番2号属于早熟品种，果实在花后40 d已达到红熟期。花后10、25和40 d果实可溶性糖的测定结果表明，转基因（RNAi）果实的葡萄糖和果糖含量显著高于野生型（WT），但两者在蔗糖含量方面没有显著差异（图2A～图2C）。此外，果实中的葡萄糖和果糖含量远远高于蔗糖含量。

淀粉含量的测定结果表明，随着生长发育的进行，转基因和野生型果实中的淀粉含量均呈现下降的趋势（图2D）。值得注意的是，转基因番茄的淀粉含量在各个发育时期始终显著高于野生型番茄。

2.3 CWIN活性上调对番茄种子生长发育的影响

上述结果表明，CWIN活性上调增加了单果鲜重。由于果实和种子的生长发育之间存在着竞争关系，因此对番茄种子的生长发育也进行了研究。结果发现，虽然转基因番茄种子的千粒重没有发生显著变化（图3A），但是转基因番茄单个果实中的种子数量下降了32%，显著低于野生型（图3B）。种子发芽实验进一步表明，转基因番茄种子的发芽率（发芽7 d后）显著降低，仅为野生型的57%（图3C）。此外，发芽势（发芽3 d后）受到的影响更为明显，转基因番茄仅为野生型的46%（图3D）。上述证据表明，CWIN活性上调不仅导致果实中种子的数量下降，同时种子质量也显著下降。

2.4 CWIN活性上调对果实叶绿素含量的影响

本研究所使用的T4代转基因番茄植株和野生型植株在开花结果之前很难从外观上进行区分，但开花结果后发现转基因番茄果实的颜色变淡（图4A），表明果实中的叶绿素含量可能出现下降。花后25 d果实叶绿素含量的测定结果表明，转基因果实中的总叶绿素含量确实显著降低，仅为野生型的62%（图4B）。由于番茄果实中叶绿素及其光合产物主要用于种子的生长发育^[18]，因此推测CWIN活性上调所导致的果实叶绿素含量下降可能是造成转基因番茄种子生长发育受到抑制的原因之一。

3 讨论

研究表明，高活性的CWIN可促进种子或果实的生长发育。例如，通过突变或转基因手段降低玉米、水稻或番茄中的CWIN活性导致其种子或果实的产量降低^[5-8]。相反，通過转基因手段增加CWIN的活性则可增加番茄在热胁迫下的座果率和产量^[9]。然而，前人在研究CWIN在果实或种子发育中的作用时，大多对种子或果实单独进行研究，很少对两者同时进行研究。通过同时研究CWIN对种子和果实发育的影响，有助于阐明果实和种子发育之间的互作和发育平衡问题，为将来定向提高种子或果实产量和品质提供理论依据。

本文同时研究了CWIN活性上调对番茄果实和种子生长发育的影响。结果发现，通过转基因手段提高番茄的CWIN活性后，单果鲜重显著增加，同时果实中的葡萄糖和果糖含量上升。但进一步对种子的研究表明，CWIN活性上升导致单个果实中的种子数量下降，同时种子的发芽势和发芽率也显著下降。这表明CWIN活性上调在促进果实生长发育的同时，也抑制了种子的生长发育。因此，番茄果实和种子生长发育之间也存在竞争和相互抑制的关系，这和在豆类上的研究结果相似^{[12， 19]}。

特别值得注意的是，转基因番茄在单果种子数量出现下降的情况下，不但单株果实数量没有下降，单果鲜重和果实己糖含量反而上升。因此本研究表明，可以通过对蔗糖分解代谢的调控来促进果实发育并抑制种子发育，从而实现提高番茄果实产量和品质的最终目的。

CWIN活性上调促进果实生长发育、但抑制种子生长发育的可能原因有2个。首先，来自叶片的光合产物主要被用于果实的生长，而不是种子的生长。其次，高活性的CWIN可通过加速分解蔗糖来降低种子或果实中的蔗糖浓度，从而促进蔗糖从光合叶片向种子/果实的转运，为种子或果实发育提供更多的能量和碳骨架^{[3， 7]}。例如，Liu等^[9]使用本研究中的转基因番茄为研究材料，发现CWIN活性上调可显著增加热胁迫下蔗糖向花后2 d果实的转运速率，从而提高了番茄在热胁迫下的座果率。本研究发现，在转基因果实鲜重增加和葡萄糖、果糖含量上升的情况下，其蔗糖含量并没有下降，这表明CWIN活性上调可能提高了蔗糖向果实的转运速率和果实中蔗糖的分解速率。

除上述来源外，转基因果实中高浓度的己糖（特别是葡萄糖）也可能来自淀粉的分解。植物白天可以把多余的光合产物以淀粉的形式储存起来供光合效率低的时候或晚上使用^[3]。转基因番茄果实的淀粉含量在整个发育时期都显著低于野生型番茄，这表明转基因果实在分解利用淀粉方面的能力要强于野生型果实。但无论这些己糖是来自于蔗糖的分解还是淀粉的分解，转基因果实可以利用的己糖要多于野生型。然而，基于本研究结果，转基因果实和种子利用己糖的能力可能并不相同，即这些己糖主要是用于果实生长（或储存于果实中），而不是用于种子的生长发育。

其次，果實叶绿素含量下降可能导致种子发育得不到充足的糖分供应。前人的研究表明，番茄果实中叶绿素及其光合产物主要用于种子的生长发育，特别是在胁迫情况下。例如，在专一性抑制果实中谷氨酸-1-半醛氨基转移酶（GSA）的表达后，番茄果实的叶绿素含量和光合速率出现下降，这导致种子早期发育进程受到不利影响，但对果实发育没有任何影响^[18]。本研究表明，CWIN活性上调导致果实中的叶绿素含量下降，这可能会导致果实光合作用下降，从而导致种子得不到充足的糖分供应，最终阻碍种子的生长发育。

需要指出的是，本研究发现CWIN活性上调对番茄种子千粒重没有显著影响，而Jin等^[13]发现CWIN活性上调导致种子单粒重增加22%。2个研究使用同一转基因材料，而研究结果却不相同，这可能是因为本研究中所使用的转基因番茄为T4代，而Jin等^[13]使用的是T2代植株。经过多代繁殖后，T4代植株可能在表观遗传水平上发生了某些变化，因而导致不同的研究结果，但需要进一步的研究来验证该假设。

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