牛细管精液冷冻温度曲线与冻精质量的研究

文/田素香 方 妍 陈 佳

（光明牧业有限公司；上海奶牛育种中心有限公司）

冷冻精液作为一种特殊的商品，对产品质量要求愈来愈高。当前评定种公牛精液品质，主要依据国标《牛冷冻精液的要求》（GB4143-2008）对采精量、原精活力、精子密度、精子冻后活力、精子畸形率五项指标进行检测。种公牛由于个体间存在差异，使以上各项指标，尤其是冻后活力出现较大差异。在实际操作中，发现有的生产性能良好和外貌优秀的公牛，由于精子抗冻性差等原因被淘汰。为提高牛精液的冷冻效果，提高制作冷冻精液的每头牛各批冷冻精液之间的稳定性，在制作冷冻精液的过程中，需研究冷冻温度曲线的变化。

1 材料和方法

1.1 精液

采自本站种公牛鲜精。

1.2 稀释液配制

按量称取所需药品，加超纯水至100 mL，溶解后过滤，75 ℃消毒30 min，降温至40 ℃以下。加入新鲜卵黄、灭菌甘油和青、链霉素充分混匀后备用。

1.3 分装方法

操作需在4 ℃冰柜中进行，四针头分装机将漏斗中的精液利用负压真空的原理通过软管和针头吸入0.25 mL塑料细管内，继而封口打印，完成分装。电脑控制的先进打印系统同时打印牛只信息，确保所有冻精的可追溯性。

1.4 平衡

分装后放入冰箱，在4 ℃中平衡2.5～4.0 h。

1.5 冷冻

将细管平置于冷冻箱内，每架盛放175 支细管，液氮熏蒸时间为7 min，然后浸入液氮中冷冻。

1.6 活力检查

活力0.40以上为合格，畸形率评定按国标《牛冷冻精液的要求》（GB4143-2008）进行。

2 精液冷冻温度曲线

精液冷冻温度曲线包括以下几个方面。

2.1 始冻温度

精液冷冻前、冷冻容器中冷冻面的温度。

2.2 热平衡温度

精液和冷冻面接触后，精液一边温度下降一边放热，使冷冻面温度回升，当二者温度一致并在短暂时间内维持不变的温度。

表1 冷冻精液降温速率表

2.3 入氮温度

冷冻细管精液和冷冻箱体温度呈同步速度迅速下降，达-140 ℃以下时，将细管冻精迅速投入-196 ℃液氮中长期保存。

2.4 降温控制

公牛精液冷冻过程降温控制如表1 所示。

3 适宜的冷冻面曲线

冷冻精液的实质是精液与冷源环境进行能量交换的过程，精液在冷冻过程中放出一定的能量后，由液相变化到固相。产生相变的原因是精液与其所处环境之间存在着极大的温度差（-196～4 ℃）。冷冻过程中它们各自向相反的方向扩散，进行能量交换，直到温度差等于零，达到能量平衡为止。其能量交换的极限值是热扩散平衡时的温度，此时，精液温度扩散的速度与精液冻结相变的速度保持一致。

精液的冷冻过程中，首先是精液温度的变化，精液由冷冻前的平衡温度呈直线下降，是一个散热过程，要求快速通过-60～0 ℃的危险温度区。当下降温度达到凝固点时，精液便随着降温梯度由液态变为固态。其次是冷冻面温度变化，选用铝板、氟板、铜网作为冻制精液的冷冻面，当精液放入后温度上升到最高点，即为精液下降温度与冷冻面上升温度达到一致，称为热平衡，冷冻面温度由上升转为下降，达到-140 ℃呈曲线变化。制作冷冻精液要求冷冻面快速达到-110～-80 ℃适宜的热平衡温度区，然后迅速下降到-140 ℃，方可能获得解冻后精子活力高的优质精液。

4 精液冷冻工艺所采用的冷冻面温度曲线

精液冷冻、解冻后活力与冻结时间有关，上海奶牛育种中心有限公司采用法国卡苏先进的电脑编制程序的冷冻器来冷冻精液，其冻后精子活力比用液氮蒸气法冷冻后的精子活力要高，而且精子存活时间更长。这是因为操作者难以控制液氮蒸汽法的初始冷冻温度和液氮水平，同时冷冻量和冷冻速度也会影响冷冻温度。公牛精液（最终甘油浓度5.0%～5.6%）冷冻过程降温控制如表1、图1。

图1 牛冷冻精液的冷冻面温度曲线

5 冷冻方法

目前国内生产的牛冷冻精液剂型主要是微型的（0.25 mL）。细管精液均匀的放置在冷冻架上，放入冷冻容器内，以液氮为冷源，通过液氮熏蒸降温、冷冻。

如有遇到细管数不多的情况，为提高冷冻效果可在下面冷冻架上放置废弃细管，避免液氮直接触碰细管精液。

6 实验结果

每次冷冻后的细管随机抽样，2010年和2011年的检测结果分别为：平均活力为0.415和0.409；平均畸形率为13.7%和1 4.5%。经统计分析冻精解冻后活力、畸形率差异显著（P＜0.01）（表2、3、4）。

表2 细管精液产量、平均活力和畸形率情况

表3 种公牛每月平均畸形率 单位：%

表4 种公牛每月平均解冻活力 单位：%

7 讨论

增加细管生产数量会影响冻精品质，导致畸形率增加。提高冻精质量的关键在于合理使用牛只，精心饲养，细致管理，具体措施如下。

7.1 种公牛日粮调配相当重要，这对保证种公牛有旺盛的性欲及优质的精液是必要的。

7.2 90%以上的牛只跛行是由蹄病或趾病造成的，建议舍饲的公牛每年进行1～2 次常规修蹄。

7.3 种公牛要经常运动，可加强肌肉、韧带及骨骼的健康，保证公牛行动活泼、性欲旺盛、精液品质优良、同时防止种公牛过肥。

7.4 严格控制采精频率，从而保证公牛的射精量和精子活力。

7.5 夏季高温高热应做好防暑降温工作，科学养牛。C