感染依赖性抗原Tp0470的鉴定及在梅毒诊断中的应用

2#张 威段君霞谭宗标夏嘉祥胡楚晖戴桂明赵飞骏

(1.南华大学病原生物研究所/特殊病原体防控湖南省重点实验室，湖南 衡阳 421001；2.邵阳学院临床检验系，湖南 邵阳 422000；3.南华大学衡阳医学院临床医学系在读本科生，湖南 衡阳 421001)

梅毒是由梅毒螺旋体(Treponema pallidum，Tp)感染引起的一种慢性持续性多阶段发展的疾病，临床表现复杂，且易与其它疾病相混淆，严重危害人类健康[1]。目前国内梅毒实验室诊断主要依赖RPR/TRUST、ELISA、胶体金等方法初筛，TPPA等方法确诊的血清学检测技术[2]。

RPR/TRUST成本低，但生物学假阳性较高；胶体金技术检测简单快速，但灵敏度不高；TPPA是目前国内常用的梅毒确诊方法之一，但试剂成本高，操作繁杂不可自动化且不能用于梅毒疗效和再感染的判定。近年来，以Tp膜脂蛋白[3-4]及鞭毛蛋白[5]为基础的ELISA和化学发光法具有操作简便、快捷、自动化、数字化运行等优势，在梅毒筛查中被广泛应用，但这些抗原仍然无法实现对疗效的评判。而基于心磷脂抗原的RPR/TRUST所检测的反应素滴度变化一定程度上能反映病原体对机体损伤程度[6]，可用于梅毒疗效评判，但血清固定现象亦很多见。鉴于以上传统梅毒血清学方法的不足，仍有必要寻找新型的诊断抗原，以进一步提高对梅毒早期诊断及临床愈后判断的价值。

Tp在早期感染机体阶段可合成分泌一些蛋白到菌体内外，称其为Tp感染依赖性抗原(体内诱生抗原)[7-8]，这些蛋白可能在感染早期诱导产生相应抗体，在Tp早期感染中具有潜在诊断价值。本研究在鉴定Tp0470蛋白感染依赖性抗原特性的基础上，建立基于Tp0470的间接ELISA法，检测468份各类临床血清样本，评价Tp0470在梅毒血清学诊断中的应用价值，为寻求新的梅毒诊断抗原提供依据。

1 材料与方法

1.1 质粒和菌株

重组质粒pET32a(+)/Tp0470、pET43.1a(+)/Tp92及E.coliRostta(DE3)株由南华大学衡阳医学院病原生物研究所成功构建并保存。Tp Nichols标准株由厦门大学医学院附属中山医院临床检测中心杨天赐主任惠赠。

1.2 实验用动物

新西兰兔(许可证号SCXK湘2015-0004)由南华大学医学科学研究中心实验动物部供应并协助管理。

1.3 主要实验试剂

Qiagen基因组提取试剂盒由德国Qiagen公司出品，Toxin EraserTM内毒素去除试剂盒由美国GenScript公司生产，二喹啉甲酸(BCA)微量蛋白纯化试剂盒购自中国上海碧云天生物技术有限公司，96孔 ELISA板购自美国Costar公司，辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗人/兔IgG二抗由美国Invitrogen公司生产，TPPA试剂盒产自日本富士瑞必欧株式会社，LZ-ELISA试剂盒(检测IgG抗体)产自中国珠海丽珠试剂股份有限公司，RPR试剂盒由中国上海科华生物工程股份有限公司出品。

1.4 血清标本来源

468例临床血清样本：梅毒阳性(一期60，二期40，三期60，隐性40，胎传14)共计214例；梅毒阴性(体检者40，孕妇46，EB病毒感染20，风湿病20，伤寒20，巨细胞病毒感染12，乙肝26，丙肝10，钩体病30，莱姆病30)共计254例。其中413份血清样本来自于南华大学附属常德市第一人民医院、衡阳市南华大学附属第一、第二医院2017年3月至2018年3月的部分住院患者；另莱姆病患者血清30份来自中国疾病控制中心，钩体病血清25份由湖南省疾病预防控制中心惠赠。以上各期梅毒及其它疾病诊断均按照行业标准进行。

1.5 重组蛋白Tp0470的克隆表达、纯化及鉴定

将重组质粒pET32 a(+)-Tp0470转化至表达菌E.coliRostta(DE3)，双酶切及测序鉴定，挑取阳性克隆扩增，IPTG(终浓度0.3 mmol/L)诱导表达目的蛋白，SDS-PAGE电泳分析。去内毒素，纯化蛋白，Western blot鉴定，测定蛋白浓度，分装后-80 ℃冻存，用于后续Tp0470-ELISA的建立和血清样本检测。

1.6 Tp0470蛋白的新西兰兔实验模型及ELISA建立

3 kg左右新西兰兔18只，随机分为三组：实验一组兔将背部剃毛处理后进行活Tp皮下接种，每只兔背部接种8个皮丘(105IFU/每个位点)，感染期间喂饲无抗生素饲料和饮水。实验二组用佐剂联合高剂量灭活Tp(106IFU/每个位点)同法接种实验兔，共接种3次(0天，14天，28天)，实验三组作为未处理对照组。结合兔背部皮丘部位出现红肿及血清学检测结果(TPPA及RPR检测阳性)判定活Tp接种成功。在接种后的8周内，三组实验兔每只每隔一周均耳缘静脉抽血1mL分离血清备用。

将纯化的Tp0470蛋白(2 mg/L)包被到ELISA反应板，同时设非感染依赖性抗原外膜蛋白Tp92(3 mg/L)为对照，加入5%脱脂牛奶，4 ℃孵育过夜，用PBS-T洗板3次，每孔分别加入100 μL各组兔血清(1∶100稀释)，37 ℃孵育2 h。PBS-T洗板5次，加入HRP标记山羊抗兔IgG二抗(1∶10 000稀释)，37 ℃反应30 min。TMB显色，20 min后加入终止液。酶标仪读取A450值，每个血清样本复测3次。

1.7 临床样本的血清学诊断评价

按上述建立的Tp0470-ELISA方法检测468份血清样本(包括梅毒阳性血清、正常人血清、交叉血清)，同时对468份血清分别按照商用检测试剂盒操作说明进行TPPA、珠海丽珠集团的ELISA梅毒初筛和RPR检测。所有血清样本需复孔检测3次。

1.8 梅毒治疗前后血清样本的RPR滴度与Tp0470-ELISA A450值相关性分析

选取上述200份各期梅毒患者血清样品(不包括14例胎传梅毒血清样本)中的20人份梅毒随访患者血清，分析比较Tp0470-ELISA A450值与RPR滴度(分为3个等级：滴度不变，滴度2倍变化，滴度4倍变化)的变化关系。

1.9 统计学分析

采用SPSS软件(18.0)对实验数据进行统计分析。感染依赖性抗原的筛选采用重复测量的方差分析；临床评价指标有灵敏度、特异度、符合率、kappa值及ROC曲线。kappa值≤0.4一致性较差，0.4

2 结 果

2.1 重组质粒pET32a(+)-Tp0470的鉴定及在E.coli Rostta(DE3)中的表达

将pET32a(+)-Tp0470重组质粒进行BamHⅠ+XhoⅠ双酶切分析，目的条带大小与预期值一致。pET32a(+)-Tp0470诱导表达目的蛋白结果如图1所示，可见一分子量约57 kDa大小的蛋白条带。

图1 重组质粒pET-32a(+)-Tp0470转化E.coli Rostta(DE3)表达结果BI:诱导前；AI:诱导后；S:上清；FT:穿透；M:Marker；E1,E2,E3,E4,E5,E6：洗脱液

2.2 Tp0470蛋白感染依赖性抗原属性的鉴定

实验组在0～8周不同时间点兔血清中特异性Tp0470和Tp92抗体检测结果如图2A、B所示。活Tp接种组兔血清中抗Tp0470水平从感染后第3周起呈急剧上升趋势，至5周后逐渐趋于平稳，而灭活Tp接种组及未接种组抗Tp0470水平一直处于低位且未有升高趋势。与灭活Tp接种组相比，活Tp接种组血清抗Tp0470水平在3～8周各时间点均有显著差异(F值分别为114.7、448.5、513.6、528.7、979.4和1688.3，P<0.05)。

图2 不同兔实验组不同时间点不同蛋白的抗体水平A450值变化A：不同兔实验组不同时间点Tp0470的抗体水平A450值变化B：不同兔实验组不同时间点Tp92的抗体水平A450值变化

活Tp接种组与灭活Tp接种组血清抗Tp92水平从接种后第3周起均呈现上升趋势，5周后逐渐趋于平稳。而在3～8周各时间点两组间差异并无显著性(F值分别为0.92、1.48、2.76、2.85、2.97和2.88，P>0.05)。

2.3 Tp0470-ELISA与TPPA、LZ-ELISA及RPR的比较评价

Tp0470-ELISA对214份各期梅毒血清样本的检测阳性率如表1所示，其中检测阴性的有10人份，对应患者年龄均大于42岁，且RPR滴度均小于等于1∶4。以TPPA法为金标准，Tp0470-ELISA检测468份血清的灵敏度、特异度及符合率如表2所示，均较好；ROC曲线下面积达到0.907(图3)。

Tp0470-ELISA与LZ-ELISA及上海科华RPR试剂盒检测468份血清结果比较(表2)，其符合率分别为94.87%，Kappa=0.897；88.67%，Kappa=0.771。均大于0.75，显示Tp0470-ELISA与这两种方法结果一致性好。

表1 基于Tp0470蛋白的ELISA对临床各期梅毒的诊断阳性率

图3 Tp0470的ROC曲线图(以Tp0470-ELISA检测S/CO为检测变量，TPPA为阴阳性判断金标准，做ROC曲线)

表2 Tp0470-ELISA与TPPA、LZ-ELISA及RPR试剂盒的诊断评价比较

2.4 梅毒患者治疗前后血清检测Tp0470-ELISA A450值与RPR滴度变化分析比较

Tp0470-ELISA做20例随访病人检测，记录其治疗前后的ELISA A450值及RPR的滴度变化，通过计算随访病人治疗前后A450值差值，分析与RPR滴度变化的情况(分为3个等级：滴度不变，滴度2倍变化，滴度4倍变化；图4)。经Spearman秩相关分析，Tp0470-ELISA A450值与RPR滴度变化相关系数为0.38，P=0.96。

图4 Tp0470-ELISA A450值与随访病人RPR滴度下降的变化图

3 讨 论

如何进一步从Tp全菌蛋白中寻找到提高梅毒早期诊断率，或能用于梅毒疗效判断的新靶标蛋白一直是当前梅毒临床诊断方法优化的突破点之一。体内诱生抗原(又称感染依赖性抗原)筛选技术的兴起[7-8]促进了空肠弯曲菌[9]、弓形虫[10]等病原体的诊断相关应用研究，感染依赖性抗原为这些病原体的诊断提供新靶标，这也为梅毒诊断抗原筛选提供了除外膜蛋白外的新思路。课题组前期研究发现，梅毒螺旋体感染依赖性抗原Tp0971[11]在早期诊断和疗效评价具有潜在价值，结合活Tp接种和灭活Tp接种后兔血清反应性的显著差异，初步证实Tp0470为一种感染依赖性抗原。

本研究基于Tp0470蛋白建立ELISA并检测了468份临床各类血清，检测结果与传统的TPPA确诊试验相比显示其具有较高的灵敏度(95.32%)和特异度(95.66%)。ROC曲线分析进一步提示Tp0470有作为梅毒诊断靶标抗原的潜质。尽管Tp0470蛋白建立的ELISA在对一期梅毒和隐性梅毒血清样本的检测中其阳性检出率分别只有91.66%和92.50%，表面上看该蛋白似乎不太适用于梅毒早期和潜伏期感染的筛选，但由于本次基于Tp0470蛋白建立的ELISA只检测了IgG型抗体，且样本来源地区相对单一及血清样本数少等局限性，尚无法做出Tp0470-ELISA不适用梅毒早期诊断的定论。仔细分析Tp0470-ELISA检测结果为假阴性的10份梅毒阳性血清的基本资料后发现其对应患者年龄均大于42岁，且样本RPR检测结果滴度均小于1∶4，这与前期研究报道的Tp0462蛋白检测为假阴性梅毒血清样本(8人份)的特征非常一致。年龄可能是造成这部分患者机体免疫应答损伤进而使这类抗原对应抗体水平低下的原因之一；也可能是这部分患者本身经历了梅毒感染到治愈的过程，导致了Tp0470蛋白刺激机体产生的IgG抗体水平逐渐下降，直至转为阴性，但RPR检测的反应素由于血清抵抗而一直保持在低滴度。

对20份随访患者治疗前后血清的A450值变化与RPR滴度变化分析后，其相关系数为0.38，P=0.96，并无显著统计学意义，这在某种程度上来说基于Tp0470建立的ELISA似乎尚无法替代RPR或TRUST判断梅毒治疗后的效果。由于抗生素的滥用，梅毒患者不一定在同一医院就诊等原因，使得随访患者的血清相对来说难以收集，导致本研究中随访患者的标本量偏少，同时由于很多患者并未严格按照医嘱进行规范化治疗和复查等原因造成收集的血清质量参差不齐，因而两种方法疗效判断是否具有相关性还有待商榷。后续研究将收集更多梅毒感染治疗后随访的各期梅毒患者(从就诊到治愈期间)血清标本，并采用新西兰兔模拟感染和治疗模型来进一步验证结果。同时结合前期筛选评价的Tp膜脂蛋白及感染依赖性抗原的优势表位肽段，合成多聚肽，期望合成的Tp多抗原多聚肽能在梅毒临床诊断和预后判断上发挥更优的作用。

作为菌体抗原研究的新靶标，感染依赖性抗原的应用并不仅仅局限于诊断，它们特殊的生物学特性：只在活菌感染宿主以后合成分泌，可能与病原体入侵机体和其自身新陈代谢密切相关[10]，研究发现免疫胸膜炎放线杆菌的感染依赖性抗原后，能有效地抑制该病原体对肺组织的损伤[12-13]。梅毒螺旋体不同于常规的革兰氏阴性菌具备典型的毒力因子脂多糖，也无法进行长期的体外单独培养，但其却能持续感染机体并引发一系列的临床症状。尽管有研究者对梅毒螺旋体进行了培养，却仍需棉尾兔细胞做载体[14]。多年来，研究者们一直致力于寻找其毒力因子，进而突破疫苗[15]和致病机制研究[16]的困境，但效果并不显著。感染依赖性抗原或许可以成为疫苗研究的新触点，同时对感染依赖性抗原进行多菌种多表型的同源性比对，筛选出同源和非同源基因，对梅毒螺旋体感染机体和自身代谢合成的机制研究都有一定价值。