环状RNA与头颈部肿瘤

姜 涛，雷芳红，黄 蕴，黄卫国

(南华大学衡阳医学院肿瘤研究所,肿瘤细胞与分子病理学湖南省重点实验室,湖南 衡阳 421001)

头颈部肿瘤(head and neck cancer，HNC)是世界上第六大常见癌症，具有高发病率和死亡率，其最常见的诱发因素包括吸烟和酗酒。除手术切除，放射和标准细胞毒性化疗干预之外的治疗选择很少。尽管治疗方法在不断改进，但HNC的存活率并未显著提高，仍只有50%左右。由于头颈部的精细和复杂的解剖结构，使根治性切除手术难以实现，迫使人们不断找寻新的治疗方法。与传统的线性RNA相比，环状RNA(Circular RNA，circRNA)不具有5′和3′末端，而是形成共价闭合的连续环。不易被核酸外切酶降解，半衰期长达48h，比线性RNA更加稳定，具有高度的保守性，组织特异性，在肿瘤诊断和治疗靶点上存在潜在的价值[1]。

1 环状RNA的形成

1971年，研究者首次在植物中发现环形植物类病毒，其基因组由闭合的单链RNA分子组成[2]。先前的观点认为，环状RNA是错误拼接的产物，并不具有生理功能。随着高通量技术的发展，越来越多的环状RNA分子被发现。目前发现的环状RNA主要来源于基因外显子，内含子也很大程度参与了其形成。目前对环状RNA的产生机制尚不明确，研究表明环状RNA通过特殊的可变剪切产生，可变形式也多种多样。外显子环化形成的环状RNA有两种模型，一种是由基因外显子共价结合构成环化的“套索驱动环化”；另一种是由双内含子互补配对形成环状结构的 “内含子配对驱动环化”，再通过剪接体剪切剩余内含子形成不同的环状RNA分子[3]。另外，由RNA结合蛋白(RNA Binding Protein，RBP)和反式作用因子也可以促进环状RNA的形成。根据环状RNA成环方式不同，环状RNA可分为仅具内含子的ciRNA;外显子来源的circRNA;由外显子和内含子共同组成的ElciRNA。此外,前体tRNA可以被切割成环以形成tricRNA。另外发现在白血病早幼粒白血病/维甲酸受体(PML/RARα)基因的染色体易位中发现了两个融合环状RNA，体内试验发现其能促进细胞转化和肿瘤生长[4]。

2 环状RNA的生物学功能

近年，随着研究的不断增多，环状RNA的各种生物学功能不断被发现，内源性环状RNA通过不同的机制参与基因表达调控，发挥不同的功能。见图1。

2.1 调控线性RNA的表达

环状RNA的形成方式多种多样，基因组同一位置可转录出mRNA和环状RNA分子，同一基因位点又可以转录出不同的环状RNA分子。环状RNA可以通过非经典剪切方式，与前体mRNA形成的经典剪切方式相互竞争，影响mRNA的表达。此外，通过内含子序列间竞争互补配对可以形成不同的环状RNA分子，这些环状RNA分子间存在竞争性平衡关系可影响到mRNA的表达。

2.2 调控亲本基因的转录

不同的环状RNA分子通过不同的途径调控其亲本基因的转录。分布在细胞核中且仅具有内含子的ciRNA可直接与DNA聚合酶II (pol II)结合促进其亲本基因的转录；保留内含子和外显子的ElciRNA首先与核糖体U1小核RNA(SnRNPs)结合形成复合物，进一步与Pol II结合促进亲本基因的转录。在细胞质中富集且仅具外显子的circRNA，可以吸附miRNA间接来调控其亲本基因的表达。

2.3 发挥内源性竞争RNA(ceRNA)的作用

研究发现，一些高度富集的环状RNA能起到ceRNA的作用。CDR1基因来源的环状RNA CiRs-7具有70个miR-7结合位点，能够大量吸附miR-7来影响哺乳动物兴奋性突触传递功能[6]。此外，circRNA_036186 通过circRNA_036186/miR-193b-3p/14-3-3ζ信号轴发挥ceRNA作用来影响头颈部肿瘤的发生发展。但是，大多数环状RNA的表达水平很低，而且只有少数环状RNA具有多个结合位点来结合一个特定的miRNA。并且环状RNA的大部分功能还未知，作为miRNA海绵可能并不是环状RNA的主要作用。

2.4 通过相关蛋白起作用

环状RNA 可以与不同的RBP结合后可影响相关蛋白的功能。多功能蛋白甘露糖结合凝集素(mannose binding lectin，MBL)可以调控circMBL及其线性mRNA的产生，让其达到一种平衡。此外，circFoxo3与ID-1，E2F1，FAK和HIFα多种蛋白结合共同作用影响其抗衰老作用。

2.5 翻译蛋白质

环状RNA结构的特殊性使其翻译蛋白的方式不同于线性RNA分子。环状RNA分子通过翻译启动元件(Internal Ribosome Entry Site，IRES)和开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)翻译蛋白质。初步研究显示，circ-ZNF609通过IRES可直接翻译蛋白并参与肌肉的发生过程[7]。此外，基于核糖体印迹分析发现果蝇大脑中也存在大量可翻译蛋白的环状RNA。

2.6 通过融合环状RNA发挥作用

基因的突变过程可以产生大量的融合基因，并普遍存在于癌症基因组中。研究发现，环状RNA也参与了这一过程，协同其他致癌因素如融合蛋白发生异常融合，促进肿瘤的发生发展[4]。

2.7 作为疾病诊断标志物

环状RNA的生物学特性，使得环状RNA在外泌体、血浆、尿液、唾液中比mRNA、miRNA，长链非编码RNA(long non-coding RNA，LncRNA)更稳定。环状RNA有望成为疾病诊断的生物标志物(表1)。

表1 环状RNA作为诊断标志物

3 环状RNA与头颈部肿瘤

环状RNA在消化，神经和免疫系统疾病中起重要作用，并且在胚胎和外泌体以及肿瘤中高度富集。与正常细胞相比，环状RNA在肿瘤细胞外泌体中大量富集，并且肿瘤患者血清外泌体环状RNA的富集程度与肿瘤的大小有关[8]。表明环状RNA在肿瘤诊断和治疗中具有潜在作用(图2)。

图2 环状RNA与头颈部肿瘤

3.1 环状RNA与口腔癌

在人口腔鳞状细胞癌(Oral squamous cell carcinoma，OSCC)中，hsa_circ_0109291表达显著增加，低表达可抑制OSCC细胞系的增殖和迁移。并且，环状RNA可通过hsa_circ_0008309-miR-136-5P/hsa-miR-382-5P-ATXN1信号轴调节口腔癌的进程[9]。此外，circRNA_100290在OSCC组织中上调，并与细胞周期依赖性蛋白激酶6(cyclin dependent kinase 6，CDK6)共表达，通过海绵吸附miR-29b家族成员调节CDK6表达，体内外实验发现敲除circRNA_100290能降低CDK6的表达并抑制OSCC细胞的增殖。此外，研究发现circSry拥有16个miR-138结合位点而发挥ceRNA的作用[10]，并且在口腔鳞状细胞癌中，miR-138显著下调，而miR-138能结合Yes相关蛋白1的mRNA的3′-非翻译区(untranslated region，UTR)来抑制细胞增殖，从而调控口腔癌的发生发展。近期研究发现，circDOCK1通过调控miR-196a-5p的表达靶向调节BIRC3，从而抑制OSCC凋亡[11]。不仅如此，OSCC患者术后唾液中hsa_circ_0001874和hsa_circ_0001971的表达水平明显降低。此外，hsa_circ_001242的表达水平与肿瘤大小和T分期呈负相关。因此，环状RNA在口腔鳞癌中起着重要的作用。

3.2 环状RNA与下咽癌

通过circRNA微阵列分析下咽鳞状细胞癌(hypopharyngeal squamous cell carcinoma，HSCC)获得2392个差异环状RNA分子。其中，1303个circRNA在HSCC组织中上调，1088个circRNA下调。在HSCC组织中，hsa_circ_0058106，hsa_circ_0058107和hsa_circ_0024108的表达显著增高。hsa_circ_0036722，hsa_circ_0002260和hsa_circ_0001189的表达显著降低[12]。但针对这些circRNA在HSCC中的作用尚未进行证实，仍需进一步实验。此外，也有研究通过分析HSCC中失调环状RNA差异谱，发现hsa_circ_0008287和hsa_circ_0005027两个环状RNA，可通过circRNA-miRNA调控网络调控miR-548C-3p的表达，通过调控miR-548C-3p的表达间接调控ErbB，Hippo信号传导途径进而影响HSCC的预后[13]。

3.3 环状RNA与喉头癌

通过高通量测序筛选喉鳞状细胞癌(Laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC)组织，获得698个差异环状RNA，其中302个表达上调和396个表达下调。其中，hsa_circRNA_100855在LSCC组织中显著上调，并且hsa_circRNA_100855的高表达与淋巴结转移和晚期临床分期有关。相反，hsa_circRNA_104912在LSCC组织中显著下调，且与TMN分期、淋巴结转移相关。最新研究发现通过检测环状RNA分子可以区分LSCC标本和正常标本[14]。综上所述，环状RNA可能在LSCC的发生发展中起重要作用，并可能有助于该疾病的诊断和预后。

3.4 环状RNA与鼻咽癌

研究发现，在鼻咽癌中[15]，miR-7可影响鼻咽癌细胞系CNE-1和CNE-2的放射敏感性，其表达水平越高，细胞对辐射的敏感性越强。ciRS-7发挥ceRNA作用，海绵吸附miR-7影响鼻咽癌的放疗敏感性[10]。并且miR-7还通过抑制EGFR/PI3K/Akt信号传导途径抑制鼻咽癌细胞增殖和集落形成。最新研究发现，在鼻咽癌患者血清和组织中，circRNA_0000285显著增加，并影响鼻咽癌患者的放疗敏感性[16]。另外，circSry通过海绵吸附miR-138影响细胞周期蛋白D1的表达，从而影响鼻咽癌的发生发展。研究报道，cir-ITCH是一种肿瘤抑制基因，在食管鳞状细胞癌中显著下调，充当miR-17和miR-214海绵，提高ITCH水平；而ITCH的过表达可促进泛素介导的蓬乱蛋白2(DVL2)降解并抑制癌基因c-Myc的表达，从而抑制Wnt /β-catenin信号转导途径来影响鼻咽癌的进程[17]。

3.5 环状RNA与舌癌

在舌鳞癌细胞中(Tongue squamous cell，TSCC)[18]，ciRS-7可海绵吸附miR-7，促进胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor 1，IGF1R)的表达，诱导由胰岛素样生长因子1(IGF1)诱导的Akt信号通路激活，促进细胞增殖和细胞周期，抑制细胞凋亡的作用。circ-ITCH海绵吸附miR-214，促进p53蛋白质的表达，抑制Bcl-2/Bax相关蛋白质的作用，达到抑癌的效果。此外，circSry通过吸附miR-138促进GNAI2的表达，影响舌鳞状细胞癌的转移。通过高通量测序分析TSCC组织和邻近组织发现，环状RNA在一定程度上参与肿瘤的发生发展，并且与肿瘤相关的miRNA具有复杂的相关性。

4 环状RNA研究策略

环状RNA在疾病中作用机制的研究是时下的热点。用于检测环状RNA表达及其功能研究的方法有很多。可以通过RNA测序和微阵列筛选目标环状RNA，然后利用逆转录-聚合酶链反应，液滴数字PCR，RNA印迹和荧光原位杂交进行验证。通过过表达或敲除实验进行环状RNA功能研究。结合生物信息学，RNA免疫共沉淀和RNA质谱进行机制研究。目前，已经开发了很多的数据库和分析工具供研究者使用(表2)。CircInteractome具有环状RNA引物和干扰RNA设计功能。ExoRBase用于分析血液外泌体中特异性环状RNA分子。通过这些免费工具，我们可以分析组织、血液、外泌体中环状RNA的差异表达，预测与之结合的miRNA，研究环状RNA分子具有的功能。

表2 环状RNA数据库

5 结 论

综上所述，环状RNA的稳定性和特异性，在靶点的准确性上优于miRNA和lncRNA，在肿瘤诊断和治疗中存在潜在的价值。如果能实现体内控制内源环状RNA在特定组织和细胞中的表达，可能增加治疗的疗效，极大降低外源物质所带来的副作用，这将增加环状RNA的价值，也将是未来基因治疗的重大突破。尽管已经初步提出了环状RNA的形成模型，但是仍需要大量的实验来探索其生成机制，包括环状RNA的产生、二级结构，以及不同RNA之间的的相互关系。目前，肿瘤中环状RNA的检测主要依赖于组织样本，而头颈部肿瘤位置的特殊性以及复杂性使组织样品获得困难，增加了临床研究难度。与组织相比，血液中的环状RNA表达通常很高，细胞可以通过外泌体将环状RNA分泌到血液中。因此，血液，尿液，唾液等更容易获得的非侵入性临床样本将在未来头颈部肿瘤环状RNA研究中广泛应用。