丝裂霉素C抑制PI3K/AKT信号通路抗宫腔黏连SD大鼠子宫内膜纤维化的机制研究

徐 芳,潘嫱微,郑加永,夏淑琦,陈玄宇,沈晓露

0 引言

宫腔黏连(Intrauterine adhesions,IUA)是引起月经稀少、闭经、不孕及早期自然流产的重要原因之一，是不孕不育的首要宫腔病因[1-2]。子宫内膜功能随体内激素水平及月经周期发生周期性增生和脱落，其功能自主恢复主要依靠基底细胞转化，一旦子宫内膜基底发生损伤，造成腺体的大量丢失，刺激成纤维细胞的大量增殖，使大量胶原蛋白聚集形成瘢痕，最终形成宫腔黏连，对女性子宫会造成严重损伤[3-4]。抗宫腔黏连瘢痕生长的药物能大幅度降低宫腔黏连的发生率，提高其治愈率，将是宫腔黏连治疗方案中的突破点。丝裂霉素C(Mitomycin C,MMC)作为经典抗瘢痕形成药物，能有效抑制中外胚层细胞的异常增生，因此,MMC极可能抗宫腔黏连瘢痕形成[5]。本研究通过观察宫腔黏连对SD雌性大鼠子宫内膜的影响，以及MMC对其PI3K/AKT通道相关蛋白的作用机制，从而发现宫腔黏连的有效的治疗方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 选用健康清洁级的雌性SD大鼠40只，9～10周龄，体重约220～240 g，适应饲养1周后，按随机数字表法分为对照组、模型组、实验组1、实验组2，每组10只。

1.2 实验仪器及试剂 ELx808IU酶联免疫检测仪(US,Bio-Tek)，蛋白电泳及转印仪(US,Bio-Tek)，丝裂霉素C注射液(浙江海正药业股份有限公司，国药准字H19999025)，IGF-I(长春金赛药业股份有限公司，国药准字S20050024)，石蜡切片机(Leica,型号2235)，体视学显微镜(Leica,型号m205FA)；图像分析系统Image-Proplus5.1(Media Cybemetics Inc.USA,型号41N5100-44800)，投射显微镜(HITACHI,JAPAN,型号H-7500)，LAS1000 CCD曝光检测系统(Fujifilm,Tokyo,Japan)，兔抗PI3K多克隆抗体(Abcam,ab32089)，兔抗AKT多克隆抗体(Abcam,ab179463)，兔抗Bcl-2多克隆抗体(Abcam,ab32124)，兔抗Bax多克隆抗体(Abcam,ab232479)，兔抗IGF-I多克隆抗体(Abcam,ab232479)，无水乙醇溶液(国药集团化学试剂有限公司)，伊红染液水溶性(珠海贝索生物技术有限公司)，苏木素染液(珠海贝索生物技术有限公司)，中性树胶(Solarbio)

1.3 模型制备 适应饲养1周后开始对模型组、实验组1、实验组2大鼠制备宫腔黏连模型。宫腔黏连模型制备参考相关文献[6-8]：用阴道涂片法确定雌性SD大鼠动情期，腹腔注射水合氯醛，经腹部中线切口暴露右侧子宫，子宫中下段做3 mm的纵向切口，用21号刀片刮除子宫内膜直至宫壁明显粗糙，清洗后缝合切口，构建宫腔黏连模型。术中及术后3、5 d，模型组大鼠不做任何处理。实验组1大鼠在术中给予1 mg/ml丝裂霉素C敷刮伤区域5 min，术后3、5 d分别用1 mg/ml的丝裂霉素C 0.2 ml进行宫腔灌注。实验组2大鼠在实验组1的用药基础上，再给予雌激素口服进行治疗。对照组为正常雌性SD大鼠，不做任何处理。各组大鼠均于术后21 d处死，取出子宫组织。

1.4 检测方法 各组大鼠用2%戊巴比妥钠腹腔深度麻醉(0.2 ml/10 g)，剪开腹腔，取出子宫组织剪碎，一部分子宫组织用0.1 mol/L的PBS(pH 7.4)液30 ml冲洗，经4%多聚甲醛固定48 h后常规石蜡包埋，连续切片(厚约4 μm)贴附于防脱载玻片上，60 ℃烤箱过夜干燥备用。一部分子宫组织迅速放入冻存管，存于-80 ℃冰箱进行Western blot检测。

1.4.1 HE染色 石蜡切片65 ℃烘烤2 h；二甲苯Ⅰ脱蜡15 min；二甲苯Ⅱ脱蜡15 min；二甲苯Ⅲ脱蜡15 min；无水乙醇Ⅰ10 min；无水乙醇Ⅱ10 min；95%乙醇Ⅰ8 min；95%乙醇Ⅱ8 min；85%乙醇7 min；75%乙醇6 min；65%乙醇5 min；苏木素染色8 min，流水冲洗3 min；0.1%盐酸酒精分化2 s，流水冲洗3 min；氨水反蓝2 min，流水冲洗3 min；伊红染色8 min，流水冲洗3 min；70%乙醇脱水2 s；80%乙醇脱水2 s；95%乙醇脱水2 s；无水乙醇脱水2 s；二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明各10 min；中性树胶封片。HE 染色通过普通光学显微镜于400×物镜下采图，以观察子宫组织细胞纤维化程度。

1.4.2 Western blot检测 从-80 ℃冰箱中取出子宫组织，加入蛋白裂解液提取总蛋白，Bradford蛋白定量法对蛋白浓度进行测定，取100 μg总蛋白进行SDS-PAGE检测，电泳后转膜，5%脱脂牛奶封闭1 h，分别加入p-AKT、p-PI3K、Bcl-2、Bax抗体(浓度1∶1 000)，4 ℃摇床孵育过夜，洗膜，膜与HPR标记的抗体孵育1 h，ECL显色，X胶片显影。以GAPDH为内参，分析相关蛋白的光密度值。

2 实验结果

2.1 MMC对各组宫腔黏连大鼠子宫内膜组织形态的影响 对照组大鼠子宫组织HE染色可见子宫内膜的黏膜层为单层柱状上皮细胞，黏膜下层可见大量腺体和血管，以及少量成纤维细胞，未见明显炎性细胞。模型组大鼠HE染色可见细胞结构紊乱，大量单层柱状上皮细胞被上皮细胞覆盖，黏膜下层腺体数量减少，细胞成纤维化增生增加。实验组1、实验组2大鼠HE染色可见细胞结构轻度紊乱，出现部分成纤维增生细胞，单层柱状上皮细胞增生明显，腺体数量有不同程度增加，与模型组比较，细胞胞浆及细胞核染色程度较浅，细胞成纤维化增生数量明显减少，其中以实验组2大鼠最为显著。见图1。

图1 MMC对各组宫腔黏连大鼠子宫内膜组织形态的影响

2.2 MMC对各组宫腔黏连大鼠子宫组织中PI3K/AKT通道相关蛋白的影响 与对照组比较，模型组大鼠子宫组织中p-AKT、PI3K、Bcl-2蛋白均显著升高，Bax蛋白表达显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较，各实验组大鼠p-AKT、PI3K、Bcl-2蛋白均显著降低，Bax蛋白表达显著升高(P<0.05)；且实验组2大鼠p-AKT、PI3K、Bcl-2蛋白含量明显低于实验组1，Bax蛋白含量明显高于实验组1(P<0.05)。见表1、图2。

图2 MMC对各组宫腔黏连大鼠PI3K/AKT通道相关蛋白的影响

表1 MMC对各组宫腔黏连大鼠PI3K/AKT通道相关蛋白的影响

注：与对照组比较，*P<0.01;与模型组比较，#P<0.05;与实验组1比较，△P<0.05

3 讨论

宫腔黏连是宫腔损伤后继发感染引起子宫内膜基底层细胞损伤，成纤维细胞过度增殖，形成瘢痕，最终形成宫腔黏连。宫腔黏连会引起患者月经周期紊乱，甚至闭经，对患者受孕及孕期造成严重影响[9-10]。有研究认为，减轻对子宫内膜的损伤能有效降低宫腔黏连的发生率[11]。目前，临床上常采用宫腔镜下宫腔黏连分离术对黏连组织进行分离，并剥离增生瘢痕组织，暴露内膜基底层及腺体[12-13]。术后可放置宫内节育器、Foley导尿管、COOK球囊等将分离后的两侧宫壁病灶区隔开预防再次黏连[14]。研究发现，宫腔镜宫腔黏连剥离术后给予激素治疗，可刺激基底层细胞及腺体增生迁移，能有效降低宫腔黏连的发生率，改善患者月经状况[15-17]。目前，治疗宫腔黏连主要通过促进子宫内膜细胞增殖，但通过促进黏连使成纤维细胞凋亡抑制宫腔黏连的研究较少。PI3K/AKT通路参与多种生物信息的传导，参与调控细胞周期、启动凋亡和细胞侵袭性等。PI3K主要由p85和p110组成，受多种细胞分子和理化因子激活，从而激活下游因子AKT。AKT是PI3K/AKT信号转导通路的核心，下游因子有NF-κB、VEGF、FOXO、BAD、mTOR、Bcl-2等，参与多项生物学事件，调控细胞存活及凋亡等。有研究发现，抑制PI3K/AKT信号通路可有效降低宫腔黏连的发生率，而MMC可通过抑制PI3K/AKT信号通路诱导细胞发生凋亡[18]。研究证实，MMC可诱导子宫内膜腺上皮细胞凋亡。MMC抗代谢、抗增殖，能有效抑制细胞增殖，尤其是抑制成纤维细胞增殖，可抑制成纤维细胞形成胶原蛋白，很大程度上降低了黏连的发生率[19-20]，其作用机制与通过抑制PI3K/AKT信号通路有关[21-22]。已有研究发现，雌激素可显著降低卵巢早衰大鼠相关的ERβ、PI3K、AKT及mTOR、mRNA含量，这与上调PI3K/AKT和mTOR信号通路相关基因和蛋白表达水平有关；亦有研究发现，雌激素可直接激活信号通路,促进细胞增生，下调子宫内膜癌组织中PR表达[23-25]。

本研究结果发现，模型组大鼠子宫组织形态细胞结构紊乱，大量单层柱状上皮细胞被上皮细胞覆盖，黏膜下层腺体数量减少，细胞成纤维化增生增加；两个实验组大鼠细胞结构轻度紊乱，出现部分成纤维增生细胞，单层柱状上皮细胞增生明显，腺体数量具有不同程度增加，说明MMC可抑制成纤维细胞增生，促上皮细胞再生及腺体恢复。本研究通过Western blot检测MMC对宫腔黏连大鼠子宫组织中p-AKT、PI3K、Bcl-2蛋白表达的影响，结果发现，与对照组比较，模型组大鼠p-AKT、PI3K、Bcl-2蛋白均显著升高，Bax蛋白表达显著降低。实验组2大鼠p-AKT、PI3K、Bcl-2蛋白含量明显低于实验组1，Bax蛋白含量明显高于实验组1。进一步说明MMC联合雌激素通过诱导相关受体将酪氨酸蛋白酶激活，诱导PI3K活化，通过信号传导至AKT，激活AKT，AKT中的PH结构可以特异识别PI3K产物，二者的高亲和力使AKT向细胞膜聚集，进一步激活。AKT进入胞质胞核影响细胞因子如BAD、mTOR、Bcl-2等，引起后续的细胞凋亡。

综上所述，本研究通过建立SD大鼠机械损伤宫腔黏连模型，在动物实体水平验证MMC对宫腔黏连大鼠PI3K/AKT信号通路的调节作用，通过抑制PI3K/AKT信号通路相关蛋白诱导子宫内膜中成纤维细胞凋亡，降低胶原蛋白分泌，降低宫腔黏连的发生率，为后期在细胞水平分析MMC抗纤维化及评估药物安全性提供支持。