铁皮石斛与金钗石斛杂交及回交后代的SSR鉴定

王培育, 郑世仲, 叶 炜, 江金兰, 颜沛沛, 李永清, 林玉玲

(1.福建农林大学园艺植物生物工程研究所，福建 福州 350002；2.福建省三明市农业科学研究院， 福建 沙县365000；3.宁德师范学院生命科学学院，福建 宁德 352100)

石斛属(Dendrobium)植物兼具观赏和药用价值[1]，其中铁皮石斛(D.catenatum)和金钗石斛(D.nobile)是较为普遍推广的2个种。铁皮石斛是药用植物中应用最广的石斛属植物之一，具有多种生物活性物质[2-4]；因其烘干呈螺旋“枫斗”状而备受推崇[5-7]。金钗石斛以茎入药，性寒、味甘，具益胃生津、滋阴清热等功效，已被列为重点保护中药材[8]。野生石斛自然繁殖率低，对生长环境要求极为严苛，长期的过度采挖使野生石斛资源逐渐枯竭[9]。目前，市场上石斛种质资源丰富且缺乏有效的鉴定技术，导致石斛品种选育严重滞后，石斛产业发展遭遇瓶颈[10]。种质资源是品种选育的基础，鉴定和分析石斛种间尤其是人工杂交后代的遗传背景成为必需步骤。DNA分子标记技术广泛应用于植物遗传关系多样性的分析，ISSR、RAPD、AFLP和SRAP等分子标记技术被广泛用于石斛分类和进化分析[11-14]，但其应用受到数量和多态性影响，在可用标记的数量、基因组覆盖、多态性区分和重复性等方面受到限制。

随着新一代测序技术的发展，铁皮石斛的全基因组序列测序已完成，简单重复序列标记(simple sequence repeat, SSR)在石斛上开发和应用也逐渐增加[15-16]。SSR标记多态性高、重复性好、呈共显性遗传模式、PCR检测方便并且能够良好覆盖基因组，在种质资源鉴定、遗传多样性等研究中发挥重要作用[17-18]。SSR标记已应用于石斛属不同种间、种内亲缘关系研究以及杂种鉴定[19]，但对铁皮石斛与金钗石斛杂交及回交未见报道。本研究对铁皮石斛与金钗石斛的杂交F1代植株及以铁皮石斛为母本回交后代植株进行鉴定，对于提高育种效率与丰富种质资源具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以铁皮石斛和金钗石斛为亲本，通过人工授粉进行杂交，建立无菌系进行单株株系分离，获得杂交后代植株。进一步以铁皮石斛为母本，选取1株杂交后代为父本，通过人工授粉进行回交，建立无菌系获得回交后代单株株系。随机抽取14株杂交F1代(编号为1～14)和18株回交1代(编号为15～32)，植株的嫩叶样品保存于-20 ℃冰箱备用。试验材料均取自福建省三明市农业科学研究院。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA的提取与检测 采用改良SDS方法提取叶片DNA[20]，用酶标仪检测DNA浓度，利用浓度为1.5%琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度，并将各样品稀释至10 ng·mL-1，保存于4 ℃冰箱待后续试验使用。

1.2.2 SSR引物获得 选取24对SSR引物(表1)，其中21对引物由李永清等[21]提供，其中3对参考刘玉洋等[9]的方法合成。以上引物均由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。

1.2.3 PCR扩增 PCR反应体系：总体积10 mL，2×Taq Master Mix 5 mL，无菌水3.2 mL，SSR上下游引物各0.5 mL，cDNA 0.8 mL。PCR扩增程序如下：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，引物退火温度下复性1 min，72 ℃延伸60 s，共40个循环后，72 ℃延伸10 min，PCR产物于4 ℃下保存。扩增产物在8%聚丙烯酰胺凝胶上恒压电泳(120 V，70 min)，Ultra GelRed核酸染料染色20 min，取出凝胶拍照保存。

1.2.4 杂种SSR鉴定 从候选的24对SSR引物中筛选出亲本均有明显条带的引物，用于杂交与回交后代的真假种鉴定。后代扩增图谱中具有父本特征的条带为真杂种，只有母本特征条带的为假杂种。

2 结果与分析

2.1 DNA检测

石斛样品DNA的D260/D280值在1.80～1.99之间，用1%琼脂糖凝胶检测其DNA纯度(图1)。从图1可见，DNA完整性较好、纯度高、无拖带弥散现象，表明可以满足石斛SSR分子标记对DNA质量的要求。

2.2 引物筛选

将24对SSR引物组合到父母本中进行扩增，筛选出13对特异性SSR引物(图2)，分别为：DNtSSR013、DNtSSR147、DNtSSR150、OA12、OA15、OA18、DM81、DM88、S122、DM123、DM178、DM186、DM199。以上引物可用于石斛杂交后代及回交后代群体真杂交种的鉴定。

表1 24对SSR引物组合名称和序列Table 1 The name and nucleotide sequences of 24 SSR primers

图1 供试石斛总DNA检测结果Figure 1 Test results of total Dendrobium DNA extracted from both parents, putative F1 hybrids and backcross progenies

图2 13对特异性SSR引物的筛选电泳Figure 2 Electrophoregrams of amplified SSR products from 13 SSR primers screening experiments

2.3 石斛杂交及回交群体SSR鉴定结果

利用筛选的13对引物对铁皮石斛和金钗石斛两亲本、14个杂交F1代及18个回交1代进行鉴定，获得DNtSSR013、DNtSSR150、OA15和DM199共4对能够有效鉴定石斛后代群体的SSR特异性引物。通过电泳条带，可将后代群体区分为母本型、父本型、真杂交种型和缺失型。(1)引物DNtSSR013在250 bp处分别有母本和父本特征条带各1条(图3)。在14个杂交后代中，编号1、5、7、8、11、12、14的7个单株同时具有母本和父本的特征条带，真杂交种率达到50%；编号3、4、6、9、10、13的6个单株为母本型，2号单株表现为缺失型。18个回交后代中，编号15、17、19、22、23、24、25、27、28、29、31的11个单株同时具有母本和父本的特征条带，其余7个单株均表现为父本型，真杂交种率达100%，能够扩增出母本特异条带的一共有11株，占61.1%。

图3 引物DNtSSR013对铁皮石斛×金钗石斛杂交及回交后代的扩增结果Figure 3 PCR amplification products from (D.catenatum×D.nobile) F1 hybrids and backcross progenies by DNtSSR013 primer pair

(2)引物DNtSSR150在220 bp处分别有1条母本特征条带和1条父本特征条带(图4)。14个杂交后代中，编号2、4、9、10、11、13的6个单株为真杂交种，真杂交种率达42.9%；编号5、8单株为母本型；其余6个单株为父本型。18个回交后代中，编号21、25、26、27的4个单株为真杂交种，编号15、17、20、22、23、24、28、31的8个单株为父本型，真杂交种率达66.7%，能够扩增出母本特异条带的一共有10株，占55.6%。

图4 引物DNtSSR150对铁皮石斛×金钗石斛杂交及回交后代的扩增结果Figure 4 PCR amplification products from (D.catenatum×D.nobile) F1 hybrids and backcross progenies by DNtSSR150 primer pair

(3)引物OA15在221～277 bp之间分别有2条母本特征条带和1条父本特征条带(图5)。14个杂交后代中，编号3、4、7、9、10、11、13的7个单株为母本型，其余7个单株为父本型。18个回交后代中，编号17、18、22、23、24、25、27、28、29、30、31的11个单株为真杂交种；编号19、26、32的3个单株为父本型，真杂交种率达到77.8%；20号单株为缺失型，能够扩增出母本特异条带的一共有14株。

(4)引物DM199在216～235 bp处分别有2条母本特征条带和1条父本特征条带(图6)。14个杂交后代中，编号2、3、4、8、11的5个单株同时具有母本和父本的特征条带，真杂交种率达到35.7%，其余9个单株均为母本型。18个回交后代中，编号17、18、20、21、24、25、26、27、28、30、31的11个单株为真杂交种，真杂交种率达到61.1%，能够扩增出母本特异条带的一共有18株，占100%。

图5 引物OA15对铁皮石斛×金钗石斛杂交及回交后代的扩增结果Figure 5 PCR amplification products of (D.catenatum×D.nobile) F1 hybrids and backcross progenies by OA15 primer pair

图6 引物DM199对铁皮石斛×金钗石斛杂交及回交后代的扩增结果Figure 6 PCR amplification products of (D.catenatum×D.nobile) F1 hybrids and backcross progenies by DM199 primer pair

利用DNtSSR013、DNtSSR150、OA15和DM199 这4对特异性SSR引物，均可从14个杂交群体和18个回交后代中鉴定出父本特异位点。其中，14个杂交群体中有6个单株能够同时被3对引物检测出父本特异性位点，11个单株能同时被2对引物检测出父本特异性位点，2个单株能同时被1对引物检测出父本特异位点。18个回交后代中，有7个单株能同时被4对引物检测出父本特异性位点，13个单株能同时被3对引物检测出父本特异性位点，17个单株能同时被2对引物检测出父本特异性位点，只有1个单株只能被1对引物检测出父本特异位点。综合来看，通过不同引物标记鉴定，32个后代单株群体中共有28个单株能够被检测出父本特异位点，占87.5%；回交后代中，被4对引物同时鉴定出真杂种率达到38.9%，以此认定为真性植株。

3 小结

石斛种类多但遗传背景复杂，由于表观上极其相似，很难从表观上进行有效鉴别[22]。基因型丰富多样易导致石斛品种混淆直至泛滥。植物新品种的不断更替推广以及种间存在不同水平的基因流，使种质资源鉴定工作难以开展，而SSR标记技术以其自身的开发优势在植物种质鉴定方面颇见成效。SSR分子标记已经在诸多物种上进行品种选育工作的研究，如贾春兰等[23]利用设计引物开发了42对SSR引物对玉米品种真伪性、纯度进行了鉴定；Yue et al[24]从研究的42个石斛杂交品种中开发了14个SSR多态性标记，并将其用于石斛品种的鉴定。

本研究选取24对特异性SSR引物对铁皮石斛、金钗石斛2个亲本进行扩增，筛选出13对特异性SSR引物用于14个杂交F1代植株和18个回交后代植株真假杂交种的鉴定，仅有4对SSR引物能够有效对石斛后代群体进行鉴定。从32个后代单株群体中鉴定出28个真杂交种，真杂交种占后代单株群体的87.5%，并且回交后代中多数能够检测到母本的特异性条带，回交植株真杂交种率达到38.9%。以上表明，SSR分子标记能够有效对石斛后代群体进行真杂交种的鉴定，通过多引物标记的方式能够提高鉴定结果的准确性。进一步通过回交技术，能够获得回交真性植株，丰富石斛种质资源。然而，有部分后代单株表现出缺失型，推测是由于配子形成过程中发生碱基突变所引起。