高活性纤维素酶食用菌菌种筛选

2019-06-18 13:35崔继鹏武秋颖范永山
唐山师范学院学报 2019年3期
关键词:高活性鸡腿菇茶树菇

徐 源,崔继鹏,武秋颖,范永山



高活性纤维素酶食用菌菌种筛选

徐 源,崔继鹏,武秋颖,范永山

(唐山师范学院 生命科学系,河北 唐山 063000)

利用刚果红染色法对生产中常见的6个食用菌菌种进行高活性纤维素酶菌株筛选,通过方差分析和α=0.01水平上的DuncanS-N-K均数间两两比较,发现鸡腿菇的产纤维素酶能力显著优于其他菌种。培养72 h时的鸡腿菇51的纤维素酶活力最高,达到33 U·μL-1,72 h后产酶能力逐渐下降。

纤维素酶;刚果红;酶活力;食用菌

食用菌,是一类能形成大型肉质(或胶质)子实体或菌核类组织并能供人们食用或药用的大型真菌。食用菌没有叶绿素,依靠降解培养物来提供自身生长所需的营养物质。因此,大型真菌的酶资源异常丰富,依靠它产生的纤维素酶、半纤维素酶和木质素酶,能分解一般动植物不能利用的纤维素,半纤维素和木质素[1-3]。食用菌品种众多,不同品种产酶组分和能力各有不同。因此,筛选产酶能力强的高活性纤维素酶食用菌迫切而重要。

本文以6个生产中常见的平菇[4]、鸡腿菇[5]和茶树菇[6]菌种为试验材料筛选高活性纤维素酶菌种,为进一步分离纯化高活性纤维素酶及其生产应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌种

平菇(平原生3、黑嘉丽、何氏200、绣针菇71)、鸡腿菇51和茶树菇TS1,均由唐山市农业科学院刘海英研究员提供。

1.2 培养基制备

PDA培养基:去皮土豆200 g、蔗糖20 g、琼脂18 g、水1 000 mL。自然pH下,121 ℃高压灭菌30 min。

固体筛选培养基:CMC-Na 2.0 g、NaCl 0.5 g、(NH4)2SO42.0 g、KH2PO41.0 g、MgSO40.5 g、琼脂18 g、水1 000 mL。自然pH下,121 ℃高压灭菌30 min。

液体发酵产酶培养基:CMC-Na 2.0 g、NaCl 0.5 g、(NH4)2SO42.0 g、KH2PO41.0 g、MgSO40.5 g、水1 000 mL。自然pH下,121 ℃高压灭菌30 min。

1.3 菌株活化及培养方法

将保存在PDA试管斜面培养基中的菌种在无菌环境下转接至PDA平板培养基中央,28 ℃倒置培养5 d,至菌丝布满培养皿。用直径0.8 cm的打孔器沿同一菌落直径打孔,用接种铲挑取菌盘,将菌盘转接至固体筛选培养基平板中央,28 ℃倒置培养6-7 d,至菌落直径达5 cm左右。再次打菌盘转接至固体筛选培养基平板中央,28 ℃倒置培养3 d,待测。

将筛选出的菌种,转接至装有5 mL液体发酵产酶培养基的15 mL离心管中,每支离心管接3个菌盘,菌盘直径0.8 cm,于28 ℃、180 rpm条件下,分别培养72 h、96 h和120 h。

1.4 刚果红染色法筛选产酶菌株

向待测平皿内加入10 mL 1.5 mg/mL刚果红染色液,静置染色20 min,然后用0.9% NaCl溶液冲洗浸泡脱色[7]。选择透明圈明显,边界清晰的平皿,分别测量透明圈直径()和菌落直径(),以透明圈直径和菌落直径的比值(/)大小作为筛选的标准[8]。

每组试验重复3次,用SPSS软件对实验数据进行方差分析。

1.5 纤维素酶活力检测

配制浓度为1.0 mg/mL的标准葡萄糖溶液,分别取出0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL至6支15 mL具塞试管中,分别加入2.0 mL的DNS试剂摇匀,沸水浴10 min,水浴结束后立即冷却,加蒸馏水定容至10 mL。用分光光度计测定540 nm处吸光度值,用Excel绘制葡萄糖标准曲线,得到回归方程为:

= 1.179 3- 0.0.015 5(2= 0.998 4)。

将产酶培养发酵液于4 ℃,4 000 rpm,离心10 min,上清液即为粗酶液。取粗酶液1.0 mL,加入1% CMC-Na溶液1.0 mL,50 ℃水浴30 min,然后加入2.0 mL DNS试剂,沸水浴10 min,水浴结束立即冷却,加蒸馏水定容至10 mL,混匀。用沸水浴10 min灭活的粗酶液作对照,测定540 nm处吸光度值,绘制葡萄糖标准曲线计算葡萄糖含量,根据酶活计算公式计算酶活。

酶活定义为:1.0 mL酶液、1.0 min催化纤维素生成1.0 µmol葡萄糖为1个酶活单位,以U·mL-1表示,计算公式为:

式中,表示粗酶液的稀释倍数;5.56为还原糖的摩尔系数;表示由吸光度从标准曲线上查得的葡萄糖浓度;表示酶解反应之后试管内溶液体积;表示反应时间;1表示所加酶液体积。

2 结果与分析

2.1 刚果红染色法筛选试验

将6个食用菌菌种在产酶筛选培养基平板上培养3 d后,刚果红染色试验结果如图1所示。由图可见,6个菌种均产生明显的浅黄色透明圈,且边界清晰。

图1 刚果红染色实验结果

对试验菌种测量D/d,结果如表1所示。对纤维素降解能力最强的是鸡腿菇71,其次为平菇各品种,降解能力最弱的菌种是茶树菇TS1。对初筛的D/d进行方差分析和α=0.01水平上的Duncan S-N-K均数间两两比较,结果表明鸡腿菇与其他菌株间差异极其显著。

表1 刚果红染色筛选测定D/d结果

2.2 纤维素酶活性检测

对鸡腿菇51进行液体培养,测定内切纤维素酶活力,结果如图2所示。

在28 ℃,180 rpm、自然pH值条件下,培养72 h时,鸡腿菇51产纤维素酶活力最高,达到33 U/µL,之后随着培养时间的延长,纤维素酶活力逐渐下降。与72h相比,发酵时间为96h时,纤维素酶活性下降了46%,到120h时,纤维素酶活性下降了79%。

图2 不同培养时间鸡腿菇产纤维素酶活力测定

3 结论

通过对6种常用的平菇、鸡腿菇和茶树菇菌种进行纤维素活性检测和产酶能力分析,发现鸡腿菇51的纤维素活性和产酶能力显著高于供试的平菇和茶树菇菌种。

[1] 黄年来.中国食用菌百科[M].北京:农业出版社,1993: 100-101.

[2] Carmen Sánchez. Lignocellulosic residues: Biodegra- dation and bioconversion by fungi[J]. Biotechnology Advances, 2009, 27(2): 185-194.

[3] 赵国萍,李迎秋.纤维素酶的研究进展及其在食品工业的应用[J].山东食品发酵,2015,45(2):37-40.

[4] 李文香,王士奎,樊铭聪,等.3种不同贮藏方式对平菇保鲜品质的影响[J].中国食用菌,2014,33(2): 53-56.

[5] 陈军,王雨净,夏志华.几种珍稀食用菌菌种纤维素酶系组分活性的比较[J].上海师范大学学报(自然科学版), 2006,5(6):76-80.

[6] 徐静娟,王树英,贡小清,等.茶树菇提取物的组分分析[J].食品工业科技,2006, 27(12): 165-167.

[7] 崔丽红,李积华,吴浩.筛选产纤维素酶丝状真菌的刚果红法之比较[J].广东化工,2015,42(1) 30-31,36.

[8] 陆晨,陈介南,王义强,等.一株产纤维素酶真菌的筛选及产酶条件优化[J].中南林业科技大学学报,2012, 32(6):118-127.

Screening of Edible Mushrooms with High Cellulase Activity

XU Yuan, CUI Ji-peng, WU Qiu-ying, FAN Yong-shan

(Department of Life Science, Tangshan Normal University, Tangshan 063000, China)

The high-cellulase-activity strains were screened by Congo red staining method from 6 common varieties of edible fungi, and the analysis of variance and the average number of Duncan S-N-K on the level of alpha=0.01 were compared. The results showed that the cellulase-producing ability ofwas significantly better than that of other strains, followed byand. The cellulase activity ofcame to the climax of 33 IU/L after 72 hours of liquid cultivation, then the enzyme production ability gradually decreased with the extension of culture time.

cellulase; Congo red; enzyme activity; edible fungi

S646

A

1009-9115(2019)03-0064-03

10.3969/j.issn.1009-9115.2019.03.018

唐山市科技计划项目(17120204a),唐山师范学院科技发展项目(2017C03、2016C05)

2018-07-19

2018-12-04

徐源(1994-),女,吉林白山人,本科生,研究方向为生物技术。

(责任编辑、校对:李春香)

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